稳定同位素技术在甘肃环县不同乡镇肉羊溯源中的应用

郄梦洁 李 政 赵姗姗 阳晓婷 赵 燕

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所农产品质量安全重点实验室， 北京 100081）

甘肃省庆阳市环县水质苦咸、矿化程度高、无污染，野生草药资源丰富，盛产地椒、麻黄等供羊食用的100多种中药材［1］。环县草场广阔，羊只年饲养量70万只以上，农户按照“10+1”模式养殖滩羊、小尾寒羊、湖羊；按照“30+2”模式养殖绒山羊和黑山羊［1］。盛产的羊羔肉是环县传统地方风味名吃，具有嫩而不膻、瘦而不柴、营养丰富、味道鲜美的特质，素有“朝登黄土地、暮住土窑洞、饥食中药草、渴饮矿泉水”的美誉［2］。“环县羊羔肉”是著名的地理标志产品，荣获全国十佳羊肉品牌第一名和全国绿色农业十佳畜牧地标品牌等殊荣［2-3］。虽然环县已逐渐形成肉羊产业的规模化、机械化、舍饲化发展，但部分散户也面临着饲养管理不规范、不分舍饲养、防疫技术滞后等食品安全问题［1，4］。此外，在巨大的经济利润刺激下，不法商人屡次将其他产地低等级的羊肉贴上地理标志羊肉的标签后投入市场［5］。为了维护消费者权益，实现政府对市场上羊肉的监管，在发生食品安全事故后快速实施产品的召回，以及对“环县羊羔肉”地理标志品牌进行保护，为“环县羊羔肉”产品打入国际市场提供技术支持，对环县肉羊进行溯源研究极为必要。

生物体内的稳定同位素组成受气候、环境、生物代谢类型等因素的影响，上述因素可导致稳定同位素分馏，从而使不同种类及地域来源的动植物食品中稳定同位素自然丰度存在差异，可作为一种“自然指纹”区分不同来源的动植物食品［5-7］。近年来，采用稳定同位素技术对肉羊进行产地溯源的报道日渐增多［8］，例如米瑞芳等［9］从内蒙古、新疆、宁夏、新西兰和意大利5个地区采集羊肉样品并利用稳定同位素技术进行产地溯源，判别准确率达100%。然而，目前的肉羊溯源研究的最小范围仅止步于县［9-11］，更小范围的产地溯源有待深入探究。此外，以往的研究通常采用羊肉组织对肉羊进行产地溯源研究［12］，需要将羊进行宰杀取肉，有采集、携带不方便，费时费力，容易变质等缺点，导致试验误差大和样品采集成本高等问题；而毛发组织和血液样品具有可活体取样、容易采取、组织性质稳定、容易保存等优点。Sun等［13］测定了我国5个不同地区2 种饲养方式下绵羊肌肉和羊毛中的δ13C、δ15N 和δ2H 值，结果表明，羊肉和羊毛的δ13C、δ15N 和δ2H 组合的判别准确率分别为88.9%和83.8%，且羊肉与羊毛中的3 种稳定同位素比值呈线性相关。由此推测，采用易取的羊毛或羊血样品进行溯源是一种更为经济、省时、省力、有效的方法。

目前还没有对乡镇级别的肉羊进行产地溯源的有效技术，不利于地理标志产品“环县羊羔肉”的品牌保护。本研究对环县肉羊羊毛和羊血样品中的碳、氮、氢、氧4 种稳定同位素比值进行检测分析，研究羊毛和羊血中稳定同位素比值的相关性，并通过对不同乡镇羊毛和羊血样品中的稳定同位素比值进行判别分析，构建乡镇级别的肉羊产地溯源模型，以期实现肉羊的活体建档，以低成本构建肉羊数据库，从而完成对“环县羊羔肉”品牌保护的目标。

1 材料与方法

1.1 样品信息

用于溯源的样品分别来自于环县南湫乡杨国礼农场和新龙辉养殖合作社，甜水乡宏康养殖农民专业合作社及曲子镇西沟村豪顺养殖专业合作社。所有肉羊均为散栏饲养，均在7 月下旬采样。每个农场各采集20 只肉羊身上的颈毛样品和全血样品，共计160 份羊血和羊毛样品。采用无添加剂的干燥真空采血管进行血液样品采集，采样量约20 mL。在每只羊的颈部贴皮层处剪取约1 cm2的羊颈毛作为羊毛样品，采样量约2 g，用密封袋保存。样品具体信息和采集样品的具体地理位置分别如表1和图1所示。

表1 环县羊血和羊毛样品地理信息Table 1 Region information of sample for sheep blood and wool in Huan county

1.2 仪器及试剂

Flash 2000-Conflo IV interface-Delta V 元素分析与稳定同位素质谱联用仪，美国Thermo 公司；WGL-230D 电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；SCIENTZ-48高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；H1850台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

氯仿和甲醇，分析纯，北京国药集团化学试剂有限公司；去离子水，杭州娃哈哈集团有限公司；USGS43、USGS62、USGS42、CBS、KHS 稳定同位素标准物质，美国Geological Survey Reston；IAEA-600 稳定同位素标准物质，奥地利国际原子能机构。

1.3 前处理方法

采集的羊毛样品用去离子水浸泡清洗后，在60 ℃条件下恒温干燥12 h。称量1.00 g清洗后的羊毛样品置于10 mL 离心管中。按照固液比1∶5 的比例加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液浸泡2 h 进行脱脂处理。样品用去离子水清洗后，浸泡30 min，再按照固液比1∶5 的比例加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液浸泡2 h。用去离子水清洗后，在60 ℃条件下将样品烘至全干（质量差小于0.02 mg）。脱脂后的羊毛样品剪成约1 mm备用。

称量1.00 g 冷冻干燥后的羊血样品置于10 mL 离心管中。按照固液比1∶5 的比例加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液进行脱脂处理。随后将样品放置在涡旋振荡器上震荡10 min。振荡结束后，样品在5 000 r·min-1条件下离心5 min。去除上清液，再次按照固液比1∶5 的比例在样品中加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液脱脂，再次震荡离心。如此重复两次后，将样品冷冻干燥至全干（质量差小于0.02 mg）。脱脂后的羊血样品经磨粉过筛后备用。

1.4 δ13C和δ15N的测定

称量150 μg 干燥脱脂后的样品用锡杯称量包裹后投入元素分析与稳定同位素比值质谱联用仪（elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometer，EAIRMS）进行碳氮同位素比值分析。样品通过自动进样器进入元素分析仪，元素分析仪的裂解管温度为960 ℃，样品中的C和N被裂解炉中的玻璃化碳还原为CO2和N2，全过程在线自动进行。CO2和N2通过气相进行分离，色谱柱温为50 ℃。CO2和N2分别经由ConFlo IV 装置进入EA-IRMS，测定C 和N 同位素的比值。载气氦气的流速为100 mL·min-1。选用USGS43（δ13C=-21.28‰，δ15N=8.44‰），USGS62（δ13C=-14.79‰，δ15N=20.17‰）和IAEA-600（δ13C=-27.77‰，δ15N=1.00‰）作为校正δ13C 和δ15N 的标准样品。δ13C 和δ15N 的分析精度均为±0.15‰。

1.5 δ2H和δ18O的测定

称量250 μg 干燥脱脂后的样品用银杯包裹后投入EA-IRMS 进行氢氧同位素比值分析。样品通过自动进样器进入元素分析仪，元素分析仪的裂解管温度为1 420 ℃，样品中的H 和O被裂解炉中的玻璃化碳还原为H2和CO，全过程在线自动进行。H2和CO 通过气相进行分离，色谱柱温为80 ℃，H2和CO 分别经由ConFlo IV 装置进入IRMS，测定H 和O 同位素的比值。载气氦气的流速为100 mL·min-1。选用CBS（δ2H=- 197‰，δ18O=3.8‰）、KHS（δ2H= -51.4‰，δ18O=20.3‰）和USGS42（δ2H=-78.5‰，δ18O=8.56‰）作为校正δ2H 和δ18O 的标准样品。δ2H 的分析精度为±3‰。δ18O的分析精度为±0.4‰。

1.6 数据分析

采用SPSS 22.0 软件对数据进行单因素方差分析（Duncan 多重比较）及线性判别分析（linear discriminant models，LDA）。采用SIMCA 14.1 软件对不同农场的羊毛和羊血样品进行主成分分析（principal components analysis，PCA）及正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。采用Excel 2016 软件对羊毛和羊血样品的稳定同位素比值进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 肉羊羊毛和羊血稳定同位素组成特征

如表2 所示，3 个乡镇羊毛样品的δ13C 和δ2H 均值大于羊血样品的δ13C和δ2H均值，而羊血样品的δ15N和δ18O 均值大于羊毛样品δ15N 和δ18O 均值。3 个乡镇羊毛样品中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O的均值分别为-16.90‰、3.94‰、-89.19‰和12.50‰。所有羊血样品中δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 的均值分别为-19.39‰、4.08‰、-112.41‰和12.87‰。

表2 3个乡镇羊血和羊毛中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值Table 2 The values of δ13C， δ15N， δ2H and δ18O for sheep blood and wool in three towns

各乡镇羊血和羊毛样品的的δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O整体均具有显著差异。羊毛和羊血中δ13C值从大到小的乡镇顺序均依次为甜水＞曲子＞南湫。南湫羊毛的δ13C 值明显低于其他乡镇羊毛的δ13C 值。羊毛和羊血中δ15N值从大到小的乡镇顺序均依次为南湫＞甜水＞曲子。羊毛和羊血中δ2H 值从大到小的乡镇顺序均依次为南湫＞甜水＞曲子。此外，南湫乡肉羊羊血中δ18O 值大于羊毛中δ18O 值，而甜水和曲子肉羊羊毛中δ18O 值均大于羊血中δ18O 值。羊毛中δ18O 值从大到小的乡镇顺序依次为曲子＞南湫＞甜水。羊血中δ18O值从大到小的乡镇顺序依次为南湫＞甜水＞曲子。曲子肉羊羊毛的δ18O值明显高于其他乡镇羊毛的δ18O值。

2.2 羊毛和羊血中稳定同位素比值的相关性

羊毛和羊血的相关性分析结果表明（图2），羊毛和羊血中δ13C 值呈显著线性正相关，相关系数为0.813，其相关系数检验的概率P值近似为0.000，说明羊血和羊毛组织δ13C 分馏速率较为一致。而羊毛和羊血中δ15N、δ2H 和δ18O的相关性较弱，相关系数分别为0.369、0.080 和0.000，其相关系数检验的概率P值均近似为0.000，表明二者的氮氢氧稳定同位素分馏速率差异较大。

图2 3个乡镇羊毛和羊血样品的相关性分析Fig.2 Correlation analysis for sheep blood and wool in three towns

2.3 稳定同位素比值对肉羊产地的判别分析

分别对3 个乡镇羊毛和羊血进行PCA 和OPLSDA 分析，结果如图3 所示。PCA 结果表明，南湫、甜水和曲子的羊毛样品被明显区分开，而甜水和曲子的羊血样品未被区分开。OPLS-DA 结果表明，无论是羊毛样品还是羊血样品，南湫、甜水和曲子3个乡镇的样品均被完全区分开。有监督的OPLS-DA 分析结果明显优于无监督的PCA分析结果。

图3 3个乡镇羊毛和血液的PCA和OPLS-DA图Fig.3 The PCA plot and OPLS-DA plot for sheep blood and wool in three towns

通过3 个乡镇羊毛和羊血样品中不同稳定同位素组合的线性判别分析结果可知（表3），不论是羊毛还是羊血样品，4 种稳定同位素组合的线性判别准确率最高：3 个乡镇的羊毛原始判别准确率为95.0%，交叉验证判别准确率为91.3%，其线性判别模型得分图如图4所示；3个乡镇的羊血原始判别准确率和交叉验证判别准确率均为97.5%。因此，羊血对环县肉羊溯源的准确度优于羊毛。此外，羊毛的碳氮稳定同位素组合原始判别准确率和交叉验证判别准确率高达92.5%，而羊血不论是碳氮稳定同位素组合还是氢氧稳定同位素组合的判别准确率均高于90.0%。

表3 3个乡镇羊毛和羊血样品中不同稳定同位素组合的线性判别分析结果Table 3 The results of LDA for different stable isotope combinations in sheep blood and wool samples from three towns

图4 以δ13C、δ15N、δ2H和δ18O为组合的3个乡镇羊毛和羊血线性判别模型得分图Fig.4 Score chart of linear discriminant model of sheep blood and wool in three towns based on four isotopic values of δ13C，δ15N， δ2H and δ18O

3 讨论

3.1 肉羊中稳定同位素比值的影响因素

动物体δ13C值与饲料中C3和C4植物的比例密切相关［14-15］。C3植物的δ13C 值（-32‰～-21‰）低于C4植物（-19‰～-12‰）［9］。动物组织δ13C 值越高，表明其饮食中含有C4植物的比例越高［12，16］。3 个乡镇羊血和羊毛样品中δ13C 值均具有显著差异。羊毛和羊血样品中δ13C值从大到小的顺序均依次为甜水＞曲子＞南湫。南湫肉羊的饲料为玉米和大燕麦草；甜水肉羊的饲料为玉米、苜蓿和育肥料；曲子肉羊的饲料为玉米、苜蓿、黄豆、小麦和干草（表1）。除了玉米为C4植物，其他均为C3植物。由此可知，甜水肉羊饲料中玉米所占比例最高，而南湫肉羊饲料中玉米所占比例最低。此外，动物体内的δ13C值在生物体内的积累与变化除与饲料相关外，还与其品种相关。南湫肉羊主要品种为山羊，而甜水和曲子肉羊为湖羊，即品种为绵羊。如表2 所示，山羊δ13C值明显低于绵羊。王倩［17］研究发现在饲料相同的情况下，阿拉善左旗的山羊中δ13C 值明显低于阿拉善右旗和额济纳旗的绵羊中δ13C 值，这与本研究结果相同。推测其原因可能是不同品种肉羊的生活习性和代谢机制不同，从而导致其体内稳定同位素的分馏差异。

各乡镇羊血和羊毛样品中δ15N 值均具有显著差异。羊毛和羊血样品中δ15N值从大到小均依次为南湫＞甜水＞曲子。前人研究表明，施用化肥种植出的饲料δ15N值较低［18］。动物食用施用化肥种植的植物饲料导致动物组织中δ15N 值也相应降低。除玉米外，南湫和甜水肉羊主要以野生大燕麦草和苜蓿为食。而曲子肉羊饲料中还包括施用化肥种植出的黄豆和小麦。此外，摄入可以直接利用大气固氮的豆科植物会导致动物体δ15N 值降低［8，11］。甜水和曲子肉羊饲料中有豆科植物，如苜蓿和黄豆。因此，南湫样品δ15N 值最高，而曲子样品δ15N值最低。

动物体δ2H 值和δ18O 值会受到地域环境的海拔、纬度、温度、气候、地形和季节等多种地理参数的综合影响［5，19］。在地域环境变化明显的情况下，动物体中的δ2H 值和δ18O 值呈现随纬度升高和海拔增加而降低的变化规律［9，20］。而本研究中羊毛样品δ18O 值从大到小依次为曲子＞南湫＞甜水；羊毛样品δ2H值与羊血样品δ2H 值和δ18O 值从大到小的顺序为南湫＞甜水＞曲水，结果与海拔和纬度无相关性。大气水随全球系统性循环，经过蒸发、冷凝和结晶等步骤最终沉降成为地下水，地下水中的δ2H和δ18O通过饮用水和饲料转移到动物组织中［21］。因此，动物体中的δ2H值和δ18O值反映了地下水中的δ2H 值和δ18O 值，与地理位置相关［22］。曲子羊毛样品的δ2H 值远小于南湫和甜水羊毛样品的δ2H值。甜水与南湫仅相距9.1 km，而甜水与曲子相距114.2 km，说明两地距离越大，羊毛样品的δ2H 值相差越大。但有关不同乡镇的地下水中δ2H、δ18O 值和动物体中δ2H、δ18O 值的相关性至今未有报道，还需进一步研究。

3.2 肉羊不同组织的稳定同位素分馏效应

以往肉羊产地溯源多采用羊肉进行溯源研究［23］，但羊肉样品具有采集、携带不方便，容易变质、误差大和成本高等问题。采用血液和毛发部位进行肉羊溯源研究除具有组织性质稳定、容易保存的特点，还具有不用宰杀取样即可为肉羊建立档案的优点。此外，血液样品和毛发样品也是非常好的溯源样品。刘泽鑫等［24］对陕西关中不同区县来源的牛尾毛样品的δ13C和δ15N 值进行检测，结果表明陕西关中不同地区肉牛组织中同位素组成存在差异，可利用牛尾毛对区县内小范围肉牛进行溯源。但本研究采用羊血和羊毛进行的是同一个县内不同乡镇的产地溯源研究，3 个乡镇的羊毛原始判别准确率为95.0%，交叉验证判别准确率为91.3%；3 个乡镇的羊血原始判别准确率和交叉验证判别准确率均为97.5%，结果也非常理想。

动物不同组织中稳定同位素组成随饮食的改变而变化，且稳定同位素分馏作用会导致动物不同组织中的同位素比值存在较大差异［25-26］。组织之间的同位素差异可以反映组织的化学成分和周转率的变化［23，27］。动物粪便或胃内容物的分析应提供有关动物即时饮食的信息［28］；血液能反映动物几个小时内到几天的短期稳定同位素变化的情况［25，29］；脂肪、肝脏、肌肉和毛发反映几星期到几个月的较长期饮食信息［29］；相比其他组织，骨胶原所反映的饮食信息时间更长［25］。可根据不同的溯源需求选择合适的采样组织。因此，羊毛样品主要反映肉羊较长期几个月的饲料中稳定同位素组成信息，而血液样品可以反映肉羊较短期几天内饲料和饮水中稳定同位素组成信息。这便是羊毛和羊血中δ13C值呈显著线性正相关，而δ15N、δ2H和δ18O值相关性较弱的原因。

3.3 稳定同位素在肉羊产地来源判别中的应用

不论是PCA分析还是OPLS-DA分析，南湫样品均与其他两乡镇的样品完全分离。南湫样品为大于6 个月的成年山羊，而曲子和甜水样品为5个月和6个月的幼年绵羊。两种羊被投喂的饲料不同，体内代谢不同，进而导致同位素分馏机制不同［17］。羊血PCA 分析结果表明，曲子和甜水样品有部分混合的现象。曲子和甜水样品虽均为湖羊，但两地的羊被投喂的饲料不同，地理位置不同。因此羊血和羊毛的OPLS-DA 分析图表明两地的样品被全部区分开。

不论是羊毛还是羊血样品，4种稳定同位素组合的线性判别准确率最高，3个乡镇的羊毛原始判别准确率为95.0%，交叉验证判别准确率为91.3%；羊血原始判别准确率和交叉验证判别准确率均为97.5%。以δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 为组合的3 个乡镇羊毛和羊血线性判别模型得分图表明，3 个乡镇的羊毛和羊血样品均被明显分开（图4）。如图1 所示，甜水与曲子相距114.2 km，而南湫与甜水仅相距9.1 km。如此小区域内的肉羊溯源，判别准确率均大于90.0%，充分表明4种稳定同位素比值在肉羊溯源领域的准确性与有效性。此外，除全部4种稳定同位素组合外，羊血和羊毛样品线性判别最有效的稳定同位素组合为δ13C 和δ15N，这主要是由3 个乡镇肉羊的年龄、品种和饲料组成不同所致。而羊血样品的δ2H 和δ18O 组合线性判别准确率也能达到91.3%。血液中主要成分是水，即羊血的δ2H 和δ18O 值主要与肉羊的饮水相关。这一结果表明，在同一区域肉羊年龄、品种和饲料组成一致的情况下，根据δ2H 和δ18O 值的差异足以区分不同小区域的肉羊。

4 结论

本研究采用稳定同位素技术结合化学计量学方法对环县南湫乡、甜水乡和曲子镇的肉羊进行产地溯源，结果表明，3 个乡镇的肉羊羊毛和羊血样品中δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 整体均存在显著性差异，且羊毛和羊血中的稳定同位素分馏速率差异较大。羊毛的4 种稳定同位素比值原始判别准确率为95.0%，交叉验证判别准确率为91.3%；羊血的4 种稳定同位素比值原始判别准确率和交叉验证判别准确率均为97.5%。本研究首次基于稳定同位素技术对乡镇级别（最小距离为9.1 km）的肉羊进行产地溯源，实现了肉羊的活体建档及低成本构建肉羊数据库，不仅为环县肉羊乡镇级别的小产地溯源研究提供了基础数据支持，也为其他食品小产地溯源研究提供了新思路。