基于微生物矿化技术的再生粗骨料改性方法研究

俞珂琼

（浙江大学 建筑工程学院，浙江 杭州 310058）

0 引 言

将建筑固废破碎、筛分制成再生骨料，不仅可以有效缓解天然资源枯竭的问题，还能解决建筑垃圾围城的现状[1]。然而，再生骨料表面附着老砂浆、吸水率高，浇筑成的再生混凝土具有更多的界面薄弱环节[2]，从而导致再生混凝土的力学性能、耐久性能均劣于普通混凝土[3-5]，这在一定程度上限制了再生混凝土的应用。因此，想要提高再生混凝土性能，推广再生混凝土在实际工程中的高附加值应用，必须对再生骨料进行改性处理。

再生骨料的改性方法主要包括物理改性法、化学改性法、碳化改性法、纳米改性法和微生物改性法等。其中，微生物改性法是利用自然界的微生物诱导生成碳酸钙（Microbial Induced Carbonate Precipitation，MICP），填充再生骨料的孔隙和微裂缝，从而提高再生骨料的性能[6]。巴氏芽孢杆菌属于中度嗜碱菌，具有较高的脲酶活性[7]，已被广泛研究用于再生骨料改性中，巴氏芽孢杆菌诱导碳酸钙沉淀过程如式（1）~（3）所示。

目前MICP 技术在再生骨料改性方面取得了一定成果，Grabiec 等[6]利用微生物诱导碳酸钙沉淀改性再生粗骨料，证明了MICP 可以修复再生骨料的孔隙和微裂纹。 微生物诱导碳酸钙沉淀的关键影响因素包括钙源浓度、可溶性无机碳的浓度、pH 值和成核位点的位置[8]，另外，温度、菌液浓度、钙源类型也会对沉淀效果造成影响，为了探究最佳的沉淀条件，提高碳酸钙的沉淀效率，Qiu 等[9]、Feng 等[10]在溶液体系中改变钙源浓度、pH 值、温度和菌液浓度因素，均得出了pH 值为9.5 时，碳酸钙沉淀质量最多的结论。此外，Feng 等[10]经过条件优选还发现钙源浓度为0.55 mol/L、菌液浓度为108 cells/mL为最佳沉淀条件。郝小虎等[11]以硝酸钙、氯化钙、乙酸钙作为钙源改性再生骨料，研究结果表明，不同钙源对再生骨料性能提升影响较小。而Achal 和Pan[12]研究发现，以氯化钙作为骨料改性钙源时，改性效果最优，沉淀物以方解石为主，且细菌分泌的脲酶活性最高。但若要将再生骨料应用于钢筋混凝土结构中，氯化钙中氯离子的引入会破坏钢筋表面钝化膜，从而影响钢筋混凝土结构的耐久性，因此学者们尝试用硝酸钙、乙酸钙、乳酸钙作为替代钙源。如何将研选后的溶液与再生骨料结合，从而达到改性骨料的目的得到了广泛关注，Wang 等[13]、吴延凯[14]、丁泽晨[15]先后采用浸泡、二次浸泡、喷洒、真空浸渍等方式，以及在浸泡方法中改变钙源引入方式，但都没有得出统一的结论。同时，学者们经过研究发现，加入骨料后的溶液体系与单一溶液体系有所区别，再生骨料的类型也会对矿化效果造成影响[16]。目前MICP 改性多集中在砂浆骨料和混凝土骨料，忽略了建筑固废来源不确定性的特点。

尽管采用替代钙源能避免氯化钙的引入，但微生物培养基中常加入氯化钠用于维持细胞的渗透压，同样也会影响微生物改性再生骨料在钢筋混凝土中的应用。且所有脲解型微生物的矿化过程都会产生氨氮副产物，会损害人体健康、污染环境，而氨氮副产物如何处理迄今尚未被研究解决。基于上述问题，本文首先研究改性过程中氯离子的去除方法，其次探究污染物氨氮副产物的去除方法，然后对比分析骨料类型对改性效果的影响，最后优选出一种高效低耗的改性方法。

1 试 验

1.1 试验材料

微生物：巴氏芽孢杆菌Sporosarcina pasteurii DSM 33，为了去除培养基中的有害氯离子，按照表1 和表2 的成分分别配制无氯增殖培养基和无氯沉淀培养基，并以含氯增殖培养基和含氯沉淀培养基为对照，培养基所用化学试剂均为分析纯，购自国药集团。接种时，按照菌液与培养基体积比为1∶20 进行接种，接种后置于摇床中培养，摇床温度设置为30 ℃，转速为200 r/min。

表1 微生物增殖培养基成分 g/L

表2 微生物沉淀培养基成分

建筑固废组分复杂，包含混凝土、砂浆、黏土砖、装修石材等多种成分，为了研究不同类型骨料的改性效果，本试验选取砂浆、烧结黏土砖、花岗岩作为研究对象。砂浆为实验室浇筑砂浆，所用原材料为：抚顺水泥股份有限公司产P·Ⅰ42.5 水泥，天然河砂，自来水。砂浆配合比及强度如表3 所示，按照GB/T 17671—1999《水泥胶砂强度检验方法（ISO 法）》养护90 d 后备用。 烧结黏土砖购自杭州市某建筑固废厂，来源于拆除的砖混结构。花岗岩购自杭州某建材厂。利用切割机将砂浆、烧结黏土砖、花岗岩切割成20 mm×20 mm×20 mm 的立方体骨料作为再生粗骨料。

1.2 试验设计

1.2.1 去氨氮副产物试验

（1）按照表1 配制无氯培养基，分别加入0、5、10、20、40、60、80、100 g/L 的人造沸石，然后放入高压灭菌锅中灭菌20 min；（2）培养基冷却后在无菌操作台中接种细菌，换上密封塞，放入摇床中进行增殖；（3）24 h 后用针筒分别抽取厌氧瓶中的气体和液体，依据HJ 533—2009《环境空气和废气 氨的测定 纳氏试剂分光光度法》和HJ 535—2009《水质 氨氮的测定 纳氏试剂分光光度法》测试气态氨氮含量和液态氨氮含量。

1.2.2 骨料改性流程

（1）70 ℃烘干骨料，直至质量变化率小于0.1%；同时通过测试菌液吸光度后稀释配制得到OD600=0.1 的菌液；（2）添加菌液使骨料表面吸附细菌，并添加沉淀培养基使之在骨料表面发生矿化反应形成碳酸钙沉淀，整个反应均在30 ℃恒温培养箱中进行；（3）改性完成后，将骨料取出，清洗再生骨料表面以去除无效沉淀，并在70 ℃下烘干备用。

1.2.3 改性参数设置

为了研究不同类型骨料的改性效果，并探究钙源浓度的影响，设置了0~0.7 mol/L 钙源浓度来改性砂浆骨料（MA）、烧结黏土砖骨料（BA）和花岗岩骨料（GA）。先将骨料浸泡在菌液中24 h，然后用无氯沉淀培养基均匀地喷洒再生粗骨料，24 h 内每隔8 h 喷洒1 次以保持骨料表面湿润。

为了探究一种合适的改性工艺，以MA 骨料为例，设置4种改性方式对骨料进行改性，并进行重复改性。改性方式设置如下，分步浸泡（I-I）：将烘干骨料置于OD600=0.1 的菌液中浸泡24 h，随后取出在无氯沉淀培养基中浸泡24 h；分步喷洒（I-S）：将烘干骨料置于OD600=0.1 的菌液中浸泡24 h，随后取出，24 h 内每隔8 h 喷洒1 次无氯沉淀培养基；混合浸泡（MI）：将烘干骨料浸泡在OD600=0.1 菌液和无氯沉淀培养基的混合溶液中24 h；混合喷洒（MS）：在24 h 内每隔8 h 用OD600=0.1 菌液和无氯沉淀培养基的混合溶液喷洒1 次，示意如图1 所示。

图1 4 种改性方式示意

1.2.4 骨料性能测试

测试改性前后骨料的质量和吸水率，然后分别计算改性后骨料的质量增加率和吸水率降低率。

1.2.5 微观结构分析

采用QUANTA FEG650 型场发射环境扫描电镜观测矿化产物的微观形貌，并采用Bruker D8 ADVANCE 型X 射线衍射仪和Jade 6.5 软件对矿化产物进行物相分析。

2 试验结果与分析

2.1 微生物生长情况

图2 为含氯增殖培养基和无氯增殖培养基培养微生物60 h 内的生长曲线。

图2 2 种增殖培养基中的微生物生长曲线

由图2 可以看出，微生物在2 种培养基中的生长情况趋势相同，均具有较好的生长能力。接种4 h 后，微生物进入对数生长期，此时2 种培养基中的微生物数量开始出现差异，无氯培养基中的微生物数量高于含氯培养基。一方面，钠盐在微生物生长过程中起到调节细胞渗透压的作用，含氯培养基中的盐浓度高于无氯培养基，会对微生物造成盐胁迫，从而抑制生长[17]；另一方面，乙酸根在微生物酶的催化作用下，可以转化生成乙酰辅酶A（CoA），进入三羧酸循环（TCA），为微生物代谢提供能量，促进微生物的生长[18]。同时，观察无氯培养基下的生长曲线可以看出，接种24 h 后，微生物OD600最高，达到0.504，说明此时溶液体系中细胞数量最多，因此选择24 h作为后续微生物扩增的时间节点。

2.2 氨氮去除效果

图3 为人造沸石去除氨氮的效果。

图3 人造沸石去除氨氮效果

由图3（a）可见，随着沸石含量的增加，增殖培养基中的NH4+含量呈先增加后减小的趋势，这是因为沸石能够通过吸附作用和离子交换作用去除溶液中的氨氮[19]。当人造沸石含量超过40 g/L 时，能够显著去除增殖培养基中的氨氮，当人造沸石含量为100 g/L 时，NH4+去除效率高达69.7%。为了探究人造沸石含量在0~20 g/L 时，NH4+含量不降反升的原因，采用平板计数法测试溶液中微生物数量，由图3（b）可见，随着沸石含量的增加，溶液中的微生物数量呈增加趋势，这意味着沸石的加入促进了微生物的生长。 由图3（a）还可以看出，增殖培养基中的NH3含量变化规律不明显，一方面，随着人造沸石含量的增加，对NH3的吸附作用逐渐增强；另一方面，人造沸石促进了微生物的生长，溶液中NH4+含量增加，促进了NH4+向NH3转化。 当人造沸石含量为100 g/L 时，NH3去除效率达51.8%。

2.2 骨料类型的影响

不同类型骨料在不同钙源浓度下改性后的质量增加率、吸水率降低率如图4 所示。

图4 骨料类型和钙源浓度对骨料物理性能的影响

由图4（a）可见，经过微生物改性后，3 种类型的骨料质量均有不同程度的增加，从整体上看，骨料质量增加率排序为BA>MA>GA，这是因为BA、MA 骨料结构疏松，孔隙率高（经压汞法测试，MA、BA 孔隙率分别为9.47%、36.22%），能够为细菌提供良好吸附条件，从而在孔隙和裂缝中发生矿化反应，而GA 骨料本身结构致密，细菌只能吸附在表面，矿化产物也仅仅是沉积在表面，黏附效果差，极易剥落，因此改性后质量几乎没有增加，说明GA 骨料不适合进行微生物改性，因此后文中不再对此进行赘述。随着钙源浓度的增加，MA 和BA 骨料的质量增加率表现出明显的先增加后降低趋势。在钙源浓度为0.3 mol/L 时，MA 骨料和BA 骨料的质量增加率达到峰值，分别为0.488%和0.787%，这是因为过高浓度的钙离子对脲酶活性有抑制作用，从而影响矿化产物的生成[20]。试验结果与Feng 等[10]的研究结果（0.55 mol/L）不一致，原因为Feng 的试验结果根据纯细菌-矿化液体系反应得到的碳酸钙质量得出，并未涉及骨料层面，而本试验在微生物矿化体系中加入了骨料，骨料会影响周围溶液的pH 值，从而影响矿化反应的进行。

由图4（b）可见，MA 和BA 骨料的吸水率在改性后均有下降，而骨料吸水率降低率排序为MA>BA，这是因为相对于BA 骨料，MA 骨料具有更高的吸水率，相同质量的碳酸钙对于MA 骨料吸水率的改善效果于BA 骨料。且随着钙源浓度的增加，MA 骨料和BA 骨料的吸水率降低率表现出明显的先增加后降低趋势。在钙源浓度为0.3 mol/L 时，2 种骨料改性后的吸水率降低率达到峰值，分别为9.05%和3.73%，因此，选择0.3 mol/L 的钙源浓度对骨料进行后续改性。

2.3 改性工艺优选

骨料在采用不同方式改性后的质量增加率、吸水率降低率如图5 所示。

图5 改性工艺对骨料物理性能的影响

由图5（a）可见，经过不同方式改性后，骨料的质量均有不同程度的增加，改性后骨料质量增加率排序为：I-I>MI>IS>MS，这表明，相比于喷洒方式（I-S 与MS），浸泡方式（I-I 与MI）生成了更多的碳酸钙；相比于混合方式（MI 与MS），分步方式（I-I 与I-S）生成了更多的碳酸钙。浸泡方式生产的碳酸钙质量更多是因为浸泡过程中，除骨料四周的矿化溶液能在骨料表面产生矿化产物外，上部矿化溶液的反应产物在重力作用下也会沉积在骨料表面，而喷洒方式依靠喷壶为骨料提供矿化溶液，但骨料孔隙吸附溶液有限。分步方式生成的碳酸钙质量更多是因为分步方式先使烘干的骨料吸附微生物，微生物更容易进入骨料的孔隙和微裂缝中发生矿化反应，相比于表面的矿化产物，孔隙和微裂缝中的矿化产物更不易被剥落。还可以观察到随着改性次数的增加，骨料的质量增加率均呈增长趋势，相比于1 次改性后质量增加率，I-I 方式、I-S 方式、MI 方式和MS 方式5 次改性后质量增加率分别增加了501%、487%、556%、528%。

由图5（b）可见，不同方式处理后骨料的吸水率均有一定程度的下降，骨料吸水率降低率排序为I-S>I-I>MS>MI，这表明，相比于浸泡方式（I-I 与MI），喷洒方式（I-S 与MS）对骨料吸水率的改善效果更佳；相比于混合方式（MI 与MS），分步方式（I-I 与I-S）对骨料吸水率的改善效果更佳。喷洒方式对吸水率的改善效果更好是因为，巴氏芽孢杆菌属于好氧菌[21]，在有氧条件下细菌大量分泌脲酶，而在无氧条件下则会停止分泌脲酶，喷洒法能使吸附在骨料表面的细菌更充分地与氧气接触，有利于矿化反应的进行。 且采用浸泡法时，微生物容易聚集在矿化液表面，而非吸附于骨料孔隙中，因此在这种情况下生成的碳酸钙沉淀主要分布在骨料的表面，这种沉淀能够增加改性后骨料质量，却对吸水率的贡献不大，这同样也是分步方式对吸水率改善效果更好的原因，即分步方式生成的碳酸钙主要位于骨料裂缝和孔隙中，混合方式主要是在溶液中生成沉淀，随后附着到骨料表面，因此对吸水率的改善效果不佳。 还可以观察到随着改性次数的增加，不同方式改性后骨料的吸水率降低率均呈现增长趋势，相比于1 次改性后吸水率降低率，I-I 方式、I-S 方式、MI 方式和MS 方式5 次改性后吸水率降低率分别增加了603%、568%、228%、282%。

降低再生骨料的吸水率，改善再生骨料和新砂浆的界面过渡区才是骨料改性的关键，即吸水率的变化幅度应是选择骨料改性工艺的决定性因素。 对比改性效果较好的两种方式（I-S 方式和I-I 方式）可知，浸泡方式（I-I 方式）在浸泡过程中消耗大量矿化液，易造成浪费，且矿化产物在重力作用下沉积在底部骨料上，容易造成骨料改性效果不均匀，且由于重力作用沉积在骨料表面的矿化产物黏附效果不佳，极易被剥落；而I-S 方式对骨料的吸水率改善效果最优，且操作简便，喷洒方式更适合工厂化作业，有利于大规模推广，因此在后续改性试验中选择I-S 方式进行改性。观察改性次数的影响可知，改性1~4 次时，各组的吸水率降低率随着改性次数的增加而增加，但在第5 次改性时，骨料吸水率改善效果不大甚至出现了不利影响，因此从经济的角度考虑，选择4 次作为骨料改性次数。 综上所述，选择4 次I-S 工艺为骨料改性的优化改性工艺。

2.4 微观形貌和物相组成分析

改性后MA 和BA 骨料表面微观形貌如图6 所示。

图6 改性后骨料的SEM 图像

由图6（a）~（d）可见，经过1 次I-S 微生物矿化改性后骨料表面生成了球形颗粒的矿化产物；由图6（e）可见，经过4次I-S 改性处理后的骨料裂缝位置覆盖了一层致密均匀的碳酸钙颗粒，填充了骨料的裂缝，因此能够显著降低骨料的吸水率；同时在矿化产物碳酸钙中观察到了杆状巴氏芽孢杆菌的印迹[见图6（f）]，这是因为矿化过程中，表面带有负电荷的细菌吸引了周围的钙离子，作为矿化反应发生的成核位点，生成的碳酸钙不断包裹细菌，当细菌表面裹满碳酸钙时，细菌死亡。将2 种培养基生成的矿化产物研磨成粉，利用X 射线衍射仪分析其物质组成，结果如图7 所示。

图7 矿化产物的XRD 图谱

由图7 可见，2 种培养基的矿化产物都主要以球霰石型碳酸钙和方解石型碳酸钙为主。

2.5 改性机理分析

微生物改性再生粗骨料的机理如图8 所示，矿化过程可以分为3 个部分：（Ⅰ）细菌黏附过程：烘干的再生骨料浸泡到菌液中，菌液在毛细管作用下渗入到再生骨料的微裂缝和孔隙中，细菌凭借表面胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）黏附到再生骨料表面上，细菌不断生长、分裂，逐渐在再生骨料表面形成微生物膜[22]。（Ⅱ）矿化反应过程：喷洒矿化液后，尿素可以通过自由扩散的方式进入细菌，在细菌新陈代谢分泌的脲酶的作用下，尿素被水解生成NH4+和CO32-，细菌体内不断累积NH4+和CO32-形成浓度梯度，NH4+和CO32-被离子泵运输到细菌外，由于细菌表面带有大量负电荷和羟基负电荷基团[23]，周围环境中带有正电荷的Ca2+就会被吸附到细菌表面，在碱性条件下，Ca2+和CO32-发生反应生成CaCO3。（Ⅲ）裂缝孔隙填充过程：随着矿化反应的不断进行，矿化产物碳酸钙不断在细菌表面累积，表面裹满碳酸钙时细菌死亡。含有有机物质的矿化产物与再生粗骨料中SiO2成分能够形成分子间的氢键作用，从而稳定地黏附在再生骨料表面[23]，在再生骨料微裂缝和孔隙中生成的矿化产物能够起到填充堵塞作用，从而降低再生骨料的吸水率。

图8 微生物改性再生骨料机理

3 结 论

（1）无氯培养基中微生物生长情况优于含氯培养基，证明了无氯培养基的可行性，且可在接种后24 h 时，微生物OD600值最高（OD600=0.504），因此选取无氯培养基进行后续试验，扩增节点选择24 h。

（2）在微生物矿化体系中加入人造沸石后，能够显著降低体系中的NH4+和NH3含量，当沸石含量为100 g/L 时，体系中NH4+和NH3的去除效率高达69.7%和51.8%。

（3）微生物改性方法可以改善MA 骨料和BA 骨料的吸水率，但不适用于GA 骨料。且当钙源浓度为0.3 mol/L 时，MA骨料和BA 骨料的改性效果最好，因此选择0.3 mol/L 作为后续MICP 改性钙源浓度。

（4）2 种不同工艺改性后骨料吸水率改善效果排序为：IS>I-I>MS>MI，且随着改性次数的增加，骨料的吸水率降低程度整体呈增加趋势，但当改性次数为5 次时，吸水率改善效果不佳，甚至出现了不利影响，因此选择4 次I-S 工艺作为优选骨料改性工艺。