miRNAs调控乳腺癌血管生成的研究进展

卢 涵 潘 卫 张 姝 黄 健

乳腺癌(breast cancer,BC)是最常见的恶性肿瘤,也是全球女性死亡的主要原因。血管生成是一个多步骤的复杂过程,从现有的血管形成新的血管,这是癌细胞通过增殖、迁移和转移阶段从而进一步发展的关键步骤[1]。癌症的特征之一是可诱导血管生成,血管生成对于为肿瘤细胞输送氧气和营养物质至关重要,并且在侵袭和转移中起着至关重要的作用[2]。血管内皮生长因子家族在新血管的形成过程中扮演了重要角色,它由7种不同的亚型组成,如血管内皮生长因子-A、血管内皮生长因子-B、血管内皮生长因子-C、血管内皮生长因子-D、血管内皮生长因子-E、PIGF-1和PIGF-2[3]。此外,哺乳动物中有3个跨膜酪氨酸激酶受体家族成员:VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3,它们控制血管和淋巴管的发育[4]。

VEGFR 由多种细胞分泌,包括炎性细胞、成纤维细胞和许多癌细胞,这些细胞都因缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)的途径使肿瘤缺氧反应增加[5]。值得注意的是,乳腺癌中的血管生成依赖于VEGFR活性,72%～98%的BC表达VEGFR,并且BC中VEGFR-A、VEGFR-C和VEGFR-D的过度表达与不良预后相关[4]。乳腺癌细胞或肿瘤微环境产生促血管生成和抗血管生成信号,决定了血管的生成与否[6]。血管生成由促血管生成和抗血管生成刺激的平衡来维持血管稳态,血管在正常条件下保持静止。一旦肿瘤开始生长或肿瘤抑制基因的缺失和癌基因的过度表达,都会打破这种平衡。了解控制肿瘤血管生成的机制对于开发新的癌症治疗策略是至关重要的。

一、乳腺癌与血管生成的关系

血管生成和肿瘤发生均与PI3K相关,PI3K是控制肿瘤生长、血管生成的重要信号通路[7]。PI3K途径在致癌作用中有两个重要的正负调节因子——PI3K和PTEN,它们在人类癌症中起关键的调控作用。PTEN主要通过脂质信号中间体磷脂酰肌醇-三磷酸的去磷酸化来控制细胞核中的PI3K信号。肿瘤抑制因子PTEN抑制mTOR,促进蛋白质翻译。有研究表明,乳腺癌中的PI3K/Akt通路可以通过PTEN的表达来抑制血管生成[7]。此外,NF-κB是由两个多肽组成的转录因子。NF-κB作为一种二聚体转录因子,控制广泛的生物学过程,包括免疫反应、应激反应、炎症、B淋巴细胞发育和淋巴器官的发育[8]。NF-κB在许多恶性肿瘤中上调,并且被认为在促进肿瘤发展中起重要作用。例如,已经发现NF-κB的过表达通过上调MDA-MB-231乳腺癌细胞中VEGF的表达来促进癌症发展和肿瘤血管生成[8]。STAT-3是一个由7种蛋白质组成的家族,它将来自活性细胞因子和生长因子受体的信号传递到细胞核,以控制基因转录[9]。在乳腺癌中,STAT3激活的基因可抑制肿瘤细胞的凋亡,刺激肿瘤细胞生长与转移及血管生成,并抑制对肿瘤细胞的免疫反应。

二、miRNAs与肿瘤的发生、发展

微小RNA(miRNAs)是非编码小RNA分子,具有大约22个核苷酸序列,miRNA的生物发生始于被称为miRNA基因或基因簇的DNA序列,它们被单独转录为miRNA分子或多顺反子转录物[10]。miRNA定位于非编码转录物的内含子区域或非翻译区域(UTR)。PolⅡ是细胞核中转录大多数miRNA的主要RNA聚合酶。初级miRNAs转录物(pri-miRNAs)在被释放到细胞质之前被加帽和多聚腺苷酸化[11]。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。RAN-GTP和exportin 5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后,另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中,其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。

miRNAs被描述为人类整个基因的重要调控者,因为它们具有调节mRNA表达的巨大潜力,通常与靶基因在3′-UTR结合。这导致mRNA转录物的降解或蛋白质翻译抑制。miRNA表达的变化导致肿瘤表型、侵袭转移和治疗耐药性的变化[12]。据估计,miRNAs占人类基因组的1%～5%,它直接调节30%的蛋白质编码基因的表达[13]。一系列研究发现,miRNA编码基因的突变或miRNA表达失调会导致广泛的人类疾病,包括癌症发展、血管生成、转移和治疗抗性。大量研究表明,内皮细胞中的miRNAs通过结合表面蛋白和信号通路影响细胞对血管生成刺激的反应[14]。

三、miRNAs调控血管生成

miRNAs在血管生成中发挥调节作用,对肿瘤的生长和转移至关重要。近年来研究显示,miRNA表达的上调和下调可能有助于肿瘤血管生成[15]。一些研究表明,miRNAs可以通过肿瘤血管生成过程中的遗传和表观遗传变化来调节内皮细胞的功能[16]。血管生成因子由内皮细胞miRNAs调节,因为它们靶向许多生长因子受体和信号分子,能够携带各种生物分子并介导细胞间通讯在血管生成中起着关键作用。外泌体介导的miRNAs信号转导在BC从初始到癌症扩散的各个阶段中的作用越来越清晰。此外,许多miRNAs是检测抗血管生成治疗反应的预测指标,特别是用作非侵入性生物学标志物。由于RNA传递技术的深入研究发现基于miRNA的治疗可以用作抑制肿瘤血管生成的新治疗方法。血管miRNAs以两种方式起作用,第一种通过靶向血管生成的负性调节因子并因此诱导血管生成,另一种是通过靶向血管生成的正性调节因子并因此抑制血管生成。在这些研究中,阐明了参与BC血管生成的miRNA调节的信号通路、抗血管生成治疗以及已用于抑制体内外血管生成的miRNA传递方法。

四、miRNAs参与乳腺癌中血管生成的信号通路

多种miRNAs控制不同类型的血管内皮生长因子的表达,血管生成依赖于支持肿瘤生长和扩散的VEGF表达的增加。在动物和细胞系中的研究发现,敲除miRNA合成中的两种关键酶(Dicer和Drosha),miRNA对血管生成有抑制或者促进作用。在乳腺癌中,miRNA-126通过靶向VEGF和PIK3R2在癌症的血管生成中起重要作用,此外,已发现MCF-7细胞中miR-126的过表达通过抑制VEGF/PI3K/Akt信号通路来减少癌症发展和肿瘤血管生成[17]。miR-204是也一种抗血管生成的miRNA,已被证明对乳腺癌有相关作用,乳腺癌细胞中的肿瘤抑制是通过靶向PI3K/Akt信号通路产生的miR-204来介导的,上述通路可抑制对肿瘤的增殖和转移[18]。此外,miR-204的表达显示出降低血管内皮生长因子水平和减少毛细血管的分支数量。

HIF是一种转录因子,对缺氧环境比较敏感。在癌症和疾病进展中,HIF上调是血管生成过程所必需的。有许多促血管生成分子,它们通过HIF-1α与其各自的启动子结合而被转录激活,HIF-1α可以附着在VEGFR1和VEGF基因启动子的HRE位点,导致VEGFR1和VEGF基因的转录[19]。在这方面发现了关于乳腺癌靶向HIF信号通路的血管miRNAs,如miR-21是一种缺氧诱导的miRNA,参与了BC患者的癌症发展、血管生成和VEGF信号的刺激。Wu等[19]揭示了在BC细胞系中miR-497的上调导致VEGF和HIF-1蛋白的减少。除此之外,miR-497的稳定转染降低了体内血管生成。此外,他们还建议miR-497可以作为一种新的通过抑制促血管生成分子(VEGF和HIF-1α)治疗乳腺癌的方法。

五、miRNA靶向乳腺癌血管生成的新疗法

miRNAs具有多种影响癌症发生、侵袭和转移的作用,将miRNA模拟物或拮抗剂传递至内皮细胞或肿瘤细胞的价值得到了制药工业的认可。BC微环境中一个重要的免疫因素是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。当循环单核细胞到达肿瘤部位时它们形成TAMs,TAMs具有促进肿瘤发展、血管形成、转移和耐药性的能力。一些研究发现,miRNAs可以通过调节肿瘤微环境中巨噬细胞来影响免疫系统的反应[20]。例如,miR-19a-3p水平的增加通过减少FRA1/STAT3信号转导和减少BC细胞迁移和侵袭来抑制M2表型。在体内乳腺癌模型中,研究人员还发现miR-19a-3p通过调节TAM抑制转移潜能[21]。

研究发现,miRNAs为新的癌症免疫治疗策略打开了闸门。肿瘤抑制因子miRNA的miRNA替代疗法包括小分子增强剂、miRNA模拟物和病毒载体。已经探索了用纳米颗粒传递以保护miRNAs免于血清核酸酶降解的方法,包括病毒和非病毒纳米颗粒递送方法,最常见的纳米颗粒是环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)。与病毒给药比较,非病毒给药具有安全性优势,可避免产生有害的免疫反应。通过中性脂质体小干扰RNA递送的EphA2基因靶向治疗已在动物模型中得到证实。上述技术还应用于在许多癌症如乳腺癌、肺癌和肾癌的临床前模型中,如使用miR-200和miR-520d抑制体内肿瘤血管生成。将正确的拮抗剂或miRNA模拟物递送到靶细胞中是将miRNA转化为药物的一种有效途径,而肿瘤内皮细胞被用作体内递送miRNA的靶标。已知肿瘤内皮细胞可与一些肿瘤细胞表达整合素αvβ5、αvβ3和cRGD结合,既往研究发现,miRNA-132拮抗剂、miR-296拮抗剂和miR-7模拟物在小鼠中使用cRGD修饰的纳米颗粒传递系统具有强烈的抗血管生成和抗肿瘤作用,通过靶向miRNA分子提供了一种新的癌症治疗方法[22]。类似地,使用具有APRPG肽基序的miRNA掺入纳米颗粒,获得了抗血管生成特性,因为APRPG对VEGFR-1具有高亲和力,miRNA纳米颗粒和一些癌细胞过度表达APRPG的VEGFR-1蛋白结合。

六、展 望

miRNAs在肿瘤血管生成中的调控作用研究取得了重大进展。尽管存在一些挑战,但在不久的将来,miRNA作为抗血管生成疗法的新型标志物和发挥抗肿瘤血管生成功能的研究策略将得到更实际的应用。靶向多种抗血管生成途径可以增强抗癌功效,因为单个miRNA可能影响许多mRNA的表达,所以miRNA在肿瘤血管生成的治疗中发挥了显著的治疗潜力。癌症和正常组织都具有血管生成的内皮细胞,因此,为了准确识别它们的生物学标志物,有必要找到能够区分这两种细胞类型的miRNAs,以此获得更精确的治疗效果,并且减少不良反应。此外,寻找将miRNA传递到体内靶细胞的策略对于开发基于miRNA的治疗方法至关重要。虽然已经研发了几种技术,但体内有效的递送策略仍然有限。此外,全身注射后的剂量依赖性毒性限制了临床应用的发展。但一项研究发现,正常细胞产生的外泌体成纤维细胞样间充质细胞在传递RNA干扰以抑制体内肿瘤胰腺细胞生长方面具有优势,同时与体外合成的纳米颗粒比较,还表现出较少量的毒性不良反应[23]。正如在体内模型中发现的,在注射成纤维细胞衍生的外泌体的小鼠中,具有高CD47表达的肿瘤细胞不能发育,上述外泌体通过靶向致癌KRAS递送减少胰腺癌中肿瘤生长的miRNAs。这项工作揭示了外泌体携带基于miRNA的药物用于医疗用途的能力。

虽然外泌体已被证明能有效靶向肿瘤细胞和内皮细胞中特定的血管生成相关miRNAs,但使用这种方法时必须考虑许多因素。通过检测miRNA表达水平揭示肿瘤相关新生血管调控的方法,可能会进一步帮助我们理解肿瘤血管生成、血管生成信号通路、miRNA靶向技术的进展可能以及提供基于miRNA的治疗前景,笔者将进一步了解miRNA作为治疗肿瘤血管生成和用作预测性生物学标志物的能力。然而,关于miRNAs在乳腺癌血管生成中的作用的临床研究是有限的,需要进一步的研究来确定调节乳腺癌患者血管生成的新治疗靶点。