秋水仙素诱导薄荷染色体加倍技术研究

王倩，钱荣，温赛群，齐琳琳，刘灵娣，武玉翠，温春秀*

（1.河北工程大学，河北 邯郸 056038；2.河北省农林科学院经济作物研究所/河北省药用植物技术创新中心，河北 石家庄 050051）

薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）别名苏薄荷、冰薄荷、野薄荷等，为唇形科薄荷属多年生草本植物，性凉、味辛，归肝、肺两经。其以全草入药，对治疗风热感冒、头痛目赤、咽喉肿痛等病症均有较好疗效。薄荷主要含有挥发油、有机酸类以及黄酮类等成分，其中挥发油为薄荷的主要药效成分之一，具有疏散风热、抗炎止痛、抑菌止痒等作用，药用价值较高[1～3]。近年来，野生薄荷已经无法满足日益增长的市场需求，人工栽培的薄荷成为了供给市场需求的主要来源，随之出现的品种混杂、产量不高、品质下降等问题逐渐暴露出来，极大地制约着薄荷产业的可持续发展。因此，选育优良的薄荷种质显得十分重要。

研究表明，染色体加倍能够创制出高产、优质、抗逆的新种质[4，5]。与二倍体植物相比，多倍体植物在获得一些优势性状的同时，遗传方面往往具有更大的可塑性，其生理上具有更强的适应性[6]。对于药用植物来说，经过人工诱变使其染色体加倍，得到多倍体器官呈巨型性、抗逆性增强、有效成分含量升高等特性的植株，正是中药材优质、高产育种期望达到的目的[7]。因此，通过人工诱导进行植物多倍体材料的创制及育种已成为当前重要的研究方向。而有效的倍性鉴定作为了解植物遗传背景和进一步应用于实际的前提，在育种过程中同样是至关重要的。倍性鉴定的准确性在很大程度上影响着植物新品种的育种效果[8]。基于此，为了加快育种进程，本研究以秋水仙素为诱变剂对薄荷茎段进行处理，通过形态学和根尖染色体观察以及流式细胞分析对其变异株进行倍性鉴定，并对不同浓度与处理时间的植株生长和诱变效果进行比较，筛选适宜薄荷染色体加倍的诱导体系，可为薄荷种质创新研究奠定坚实基础，且变异植株经进一步的培育后有望作为新品种在生产上推广应用[9～11]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料为河北省农林科学院经济作物研究所药用植物研究中心培育的安徽薄荷组培苗。

仪器主要有SW-CJ-18U 型超净工作台（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、Thermo ST8 ST8R热电高速冷冻离心机（美国）、Beckman CytoFLEX 流式细胞仪（美国） 和Olympus BH-2 型显微镜（日本）等。

药剂主要有秋水仙素（C22H25NO6）、乙醇、冰醋酸、改良卡宝品红染液、盐酸和DAPI 染色液等。除秋水仙素购于美国Sigma 公司外，其他试剂均购于北京博奥拓达科技有限公司。

培养基有再生试管苗培养基和生根培养基2 种。其中，再生试管苗培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖20 mg/L+琼脂6.5 g/L，pH 值5.8。

1.2 试验方法

采用秋水仙素加入培养基的方法，对带有腋芽的薄荷茎段进行处理，诱导薄荷多倍体的产生；通过形态学和根尖染色体观察以及流式细胞分析对其变异株进行倍性鉴定，并对不同浓度与处理时间的植株诱变效果进行比较；对变异株与亲本植株的田间生物学性状和挥发油含量进行比较。

1.2.1 变异植株的获得 在无菌工作台中，将薄荷试管苗茎段（带有腋芽）分别接到含有不同浓度秋水仙素的MS 培养基上，进行不同时间的暗处理培养；后接种至再生试管苗培养基中，在温度（25±2）℃、光照12 h/黑暗12 h 的光照培养箱中诱导薄荷试管苗的产生。试验秋水仙素浓度设50 mg/L（T1）、100 mg/L（T2）和200 mg/L（T3）3 个处理，以不添加秋水仙素处理为对照（CK），每个处理均接20 个茎段，3 组重复；暗处理时间均设1、2 和3 d。

接种后，以周期性观察并记录茎段或再生苗的生长状态，每15 d 为1 个记录周期；第60 天时统计再生苗数量，计算诱变率。参考赵忠娟等[4]方法，将褐化、未产生再生苗判定为茎段死亡，将叶片明显较大、颜色较绿的再生苗植株初步判定为变异植株。

1.2.2 变异植株的移栽 将变异植株和CK 植株从组培瓶中取出，先用流水冲洗干净，再用0.1%多菌灵浸泡灭菌，之后移栽到事先用高锰酸钾溶液消毒过的蛭石中，编号并覆膜，在常温条件下通风培养。

1.2.3 流式细胞检测分析 取适量叶片置于培养皿中，加提取缓冲液1.5～2.0 mL，用刀片将其切碎，以便提取出完整细胞核。使用滤网过滤至新的离心管中，1 000 r/min 离心3 min，倒出提取液后，向试管中加入50 μL 染液，避光染色1 min，利用流式细胞仪检测植株倍性，荧光通道选择PB450-A。

1.2.4 根尖染色体数目鉴定 8：00～11：00 取薄荷1 cm 左右的幼根放入冰水混合物中，4 ℃条件下预处理24 h，蒸馏水清洗过后用卡诺固定液〔V（95%乙醇） ∶V（冰醋酸） =3 ∶1〕处理24 h（不超过24 h），转入70%乙醇中保存。60 ℃下用1 mol/L 的盐酸解离4 min，用蒸馏水将其冲洗后使用改良卡宝品红染液进行染色，压片，在光学显微镜下观察并拍照。

1.2.5 移入田间多倍体植株的生物学性状调查 多倍体植株和CK 植株移栽成活后，将其移入试验田，在相同条件进行培养。达到采收标准后，观察变异植株与亲本植株叶片及植株长势形态方面的差异。每个处理随机选取3 株，用尺子测量叶长、叶宽和株高等，并采用常规方法测定植株的鲜重和干重。

1.2.6 移入田间多倍体植株的挥发油含量测定 将移入田间的多倍体植株和CK 植株的地上部分采收，阴干后切成段，用粉碎机粉碎成颗粒均匀细腻的粉末。取供试品适量，采用挥发油测定装置测定薄荷挥发油含量，计算供试品的挥发油含量。

1.3 数据统计分析

采用Microsoft Office Excel（2003）软件进行数据整理，采用SPSS 19.0 统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素处理对薄荷茎段的诱导效果

秋水仙素的处理浓度和处理时间均对薄荷茎段的存活与突变具有较大影响（表1）。试验浓度秋水仙素处理的薄荷茎段均可成活，但观察发现，其诱导出的再生苗生长缓慢，且部分茎段出现了不同程度的褐化、死亡现象；而对照茎段的再生苗长势良好，成活率较高。

随着秋水仙素处理浓度的增大和处理时间的延长，再生苗诱导数量趋于下降，茎段褐化现象加重，甚至失去生活力。处理时间为1 d 和2 d 时，诱变效果较好，成活的再生苗中均出现了一些突变株，诱变率最高可达33%。处理时间为3 d 时，各浓度处理下诱导产生的再生苗株数相对较少，且诱变率均为0。对茎段的诱导以及再生苗的生长状况进行综合分析，认为T21处理（秋水仙素处理浓度100 mg/L、处理时间1 d）效果最好。该处理下，薄荷茎段成活数量较多、突变数最多，诱变率最高，达到了33%。

2.2 秋水仙素诱导薄荷的倍性鉴定

2.2.1 组培苗形态学观察 利用裸眼观察法对相同组培条件下由秋水仙素诱导产生的再生苗与CK 再生苗的生长状态进行比较，结果（图1）显示，二者在形态上出现了显著变化，由秋水仙素诱导产生的再生植株总体表现为叶片变大且肥厚、颜色浓绿、锯齿较深、茎秆粗壮等，符合多倍体特性，但生长速度明显降低。

图1 变异植株与亲本植株（CK）的生长状态比较Fig.1 Comparison of growth status between variant plants and parent plants（CK）

2.2.2 流式细胞检测及根尖染色体鉴定 利用流式细胞仪对初步鉴定的变异植株和亲本植株（CK） 进行染色体倍性鉴定，结果（图2）显示，CK 植株的二倍体峰值处于65×104道附近；变异植株T11-3-2、T22-1-4 和T32-1-1 的四倍体峰值处于130×104道左右，约为对照的2 倍。可以看出，峰值出现与染色体倍性关系准确。

利用染色压片法对变异植株和亲本植株（CK）进行根尖染色体鉴定，结果（图3）显示，变异植株的根尖染色体数量明显多于CK。根尖染色体法的多倍体鉴定结果与流式细胞检测法的多倍体鉴定结果一致。

图3 薄荷变异植株与亲本植株（CK）的根尖染色体比较Fig.3 Comparison of root tip chromosomes between variant plants and parent plants（CK）of peppermint

2.3 多倍体植株的田间生物学性状和挥发油含量

2.3.1 田间生物学性状 采收期的调查结果（表2）显示，各多倍体植株的田间生物学性状均与亲本植株（CK）具有明显差异。多倍体植株中，株高除T11-3-1 略＞CK外，其他植株均明显＜CK；分枝数除T21-1-4＞CK 外，其他植株均＜CK，但所有植株与CK 差异均不显著；叶片厚度均＞CK，且除T11-3-1 外，其他植株与CK 差异均达到了显著水平；植株鲜重和干重均显著＜CK；叶片长度和宽度除T23-3-1、T11-2-2、T22-1-4 和T21-1-4＞CK 外，其他植株均＜CK。裸眼观察也发现，与CK 植株相比，多倍体植株在田间普遍表现为叶厚、生长缓慢（图4）。

图4 多倍体植株与亲本植株（CK）的田间形态比较Fig.4 Comparison of field morphology between polyploid plants and parent plants（CK）

表2 采收期多倍体植株与亲本植株（CK）的田间生物学性状比较Table 2 Comparison of field biological traits between polyploid plants and parent plants（CK）at harvest time

2.3.2 挥发油含量 《中国药典》2020 版规定薄荷药材的挥发油含量不得少于0.80%。测定结果（图5）显示，亲本植株（CK）的挥发油含量为1.12%；多倍体植株的挥发油含量为0.77%～2.21%，有8 个植株的挥发油含量＞CK，其中T11-3-1 的挥发油含量最高，为亲本植株的1.97 倍。有2 个多倍体植株的挥发油含量＜CK，其中T32-1-1 的挥发油含量（0.87%）最低，但其挥发测量油含量也达到了药典标准。可以看出，多倍体植株的挥发油含量普遍高于亲本植株。

图5 采收期多倍体植株与与亲本植株（CK）的挥发油含量比较Fig.5 Comparison of volatile oil content between polyploid plants and parent plants（CK） at harvest time

3 结论与讨论

多倍体是植物存在于自然界的一种普遍现象，能够使植物以跳跃的方式改变其外观形态和生理指标，同时发生染色体加倍，快速产生新的种质资源[12～14]。目前在多倍体植物资源创新中，利用秋水仙素诱导是应用较广泛且有效的手段之一。但高浓度的秋水仙素容易对细胞产生毒害作用，使植株难以恢复分裂能力，甚至死亡[15]。周玉丽[16]研究显示，用浓度为0.3%的秋水仙素处理连翘幼苗，变异率相对较高，但成活率较低；当浓度调节至0.2%并处理72 h 后，诱导效果最为理想，变异率高达58.3%。施和平等[17]研究显示，用0.05%的秋水仙素处理广藿香毛状根36 h，诱导效果最佳，诱导率可达40%；延长处理时间并增大秋水仙素浓度后，诱导率趋于下降。因此，选择适宜的诱变材料，以及把握合适的秋水仙素浓度和处理时间至关重要。本研究中，以不同浓度的秋水仙素为诱变剂，对带有腋芽的薄荷试管苗茎段进行诱变处理，结果表明，在培养基中添加秋水仙素诱导薄荷产生多倍体植株的方法是可行的，且诱导效果明显，通过流式细胞检测、根尖染色体数目观察等方法共鉴定出多倍体植株10 个；同时，在多个梯度条件下筛选得到秋水仙素诱导薄荷染色体加倍的最适体系为秋水仙素处理浓度100 mg/L、处理时间1 d。

在薄荷染色体加倍的研究中，赵忠娟等[4]发现通过秋水仙素诱导的椒样薄荷，其变异植株较亲本植株长势快，株高明显高于亲本植株。于盱等[18]则认为不同品种在染色体加倍后变异现象和生长速度存在一定的差异，在相同组培条件下68-7 薄荷的染色体加倍植株与正常植株相比长势缓慢，但73-8 和沪-39 薄荷的染色体加倍后植株生长速度与其正常植株相比无明显变化。本研究结果显示，薄荷诱导染色体加倍后的植株，无论是在形态特征方面还是在生理特征和挥发油含量等方面均与亲本植株存在不同程度的差别，主要表现为叶片变得肥大且厚、茎秆变粗、锯齿相对更深，但生长速度缓慢；多数变异植株的挥发油含量高于亲本植株，最高含量可达2.21%，为亲本植株（1.12%）的1.97 倍。后期将采用其他诱变手段，在诱变剂的选择、浓度及时间的处理上进行更多尝试，探索能够更直观反映基因水平变异的快速、有效检测评价技术[19]，以期在强化诱变效果的同时，为多倍体鉴定技术的进步提供强有力的支撑，这对加快我国药用植物新品种的开发以及优良品种的筛选起到重要作用[20]。