葛根素抑制自噬改善脂多糖诱导的小鼠肝脏损伤作用研究＊

赵裕沛，朱益敏，徐小勇，贺彬婵，闵海燕，王 嫘

（1. 南京中医药大学第二附属医院 南京 210017；2. 江苏省中西医结合医院，江苏省中医药研究院 南京 210028）

肝脏是感染早期损伤靶标之一，其功能障碍是多器官功能障碍的关键标志之一，也是重症监护病房患者常见死因[1]。肝损伤不仅会导致肝功能衰竭，造成急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF），还会加重整体病情，影响预后，甚至导致死亡。ALF 病程迅速，病死率高，目前临床缺乏有效干预手段。针对早期肝损害的预防或治疗可有效改善预后[1-3]。

葛根始记于《神农本草经》：“葛根，消渴，身大热，呕吐，诸痹，起阴气，解诸毒”，是豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根，味甘辛性凉，归肺胃经，常用于外感热病、麻疹、脾胃系统疾病等，并可用于解酒。葛根素（Puerarin，PUE）是一种来源于中药葛根的异黄酮类单体化合物，因具有多种生物活性，如抑制氧化应激、改善胰岛素水平、减轻炎症反应、抑制细胞凋亡等，常用于多种疾病的治疗，包括糖尿病肾病、心脑血管疾病、骨骼生成异常、老年痴呆及肿瘤[4-5]。葛根素对慢性代谢性疾病的肝脏损伤表现出一定的保护作用[6-7]。在急性肝损伤研究中，LPS 可引起强烈的免疫反应[4-5]。LPS诱导的急性肝损伤模型是目前常用的肝脏损伤机制研究模型[4-5,8]。葛根素可通过降低细胞死亡率，改善肝损表型，但具体分子机制仍未完全阐明[9]。

本研究利用LPS 诱导小鼠急性肝损伤模型，在刺激30 min 后，采用葛根素干预治疗，评估葛根素对模型小鼠肝脏病理表型的改善作用，并进一步探讨相关分子机制。

1 材料和方法

1.1 动物分组

SPF 雄性C57BL/6J 小鼠（6 周龄，20-25 g）18 只，购于江苏省集萃药康生物科技股份有限公司。所有购买小鼠在SPF 条件下，维持饲养1 周后，随机分为对照组（Normal contrast，NC），肝损模型组（LPS）和葛根素干预组（LPS+PUE），每组6只。

本研究所涉相关动物实验均按照动物福利进行实验设计，实验过程遵循科技部的《实验动物指南》，并严格按照《实验动物护理和使用指南》（南京大学，伦理批准文号：IACUC-2003071）进行。小鼠处理参考文献方法[8,10]，具体如下：肝损模型组小鼠（腹腔注射10 mg·kg-1LPS），葛根素干预组（腹腔注射10 mg·kg-1LPS，30 min 后，腹腔注射100 mg·kg-1葛根素），正常组（腹腔注射，等体积PBS溶液）。

1.2 细胞培养和处理

人肝细胞系LO2 购自中国科学院上海细胞所。细胞培养条件为：添加10%（v/v）胎牛血清和1%青霉素链霉素的Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM）培养基，维持37℃，5% CO2的培养条件，每2 天更换1 次培养基。待细胞生长至60%-70%密度时，将LO2 细胞转移至6 孔板，进行以下处理：LPS（100 ng·mL-1）处理30 min 后，加入浓度葛根素溶液（20 µmol·L-1），处理24 h 后，提取细胞蛋白质，进行特定蛋白质表达水平测定。

1.3 主要试剂

脂多糖（美国Sigma 公司）；葛根素注射液（广州白云山天心制药股份有限公司）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）ELISA 剂盒（上海麦约尔生物技术有限公司）；二辛酸（Bicinchonininc acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo Scientific 公司）；ECL Plus 蛋白质印迹检测试剂、P53抗体、Elite ABC 试剂盒、3,3’-二氨基联苯胺（DAB）底物、蛋白酶及磷酸酶抑制剂、RIPA 裂解液（美国Millipore 公司）；DMEM 培养基、胎牛血清，青霉素链霉素（美国Gibco 公司）；TLR4 抑制剂TAK-242（美国Sigma公司）；Cleaved Caspase3、Beclin1、p62、LC3、磷酸甘 油 醛 脱 氢 酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、肌纤蛋白（Actin）抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；TRIzol 试剂，iScript cDNA合成试剂盒（中国Vazyme公司）。

1.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）测定肝酶活性

小鼠处理24 h 后，异氟烷麻醉，眼球取血后，2000 r·min-1离心10 min，取上层血清，根据ELISA 试剂盒说明书的操作说明，检测小鼠血清ALT 和AST活性。

1.5 HE染色、免疫组化、免疫荧光分析

小鼠经断颈处死后，取肝脏左叶约2 cm3组织，经4%多聚甲醛溶液固定，剩余肝组织放入-80℃冰箱保存备用。固定的肝组织经石蜡包埋后切片，经苏木精和伊红染色，光学显微镜下进行肝组织形态学观察。

选择P53 免疫组化抗体孵育，4℃过夜，Elite ABC试剂盒和DAB 底物进行免疫组织化学染色，光学显微镜下观察P53的表达水平。

1.6 实时荧光定量PCR

使用TRIzol 试剂从组织样品分离提取总RNA，逆转录成cDNA（iScript cDNA 合成试剂盒），使用SYBR green PCR Master Mix 定量检测相应基因的转录水平，所用仪器为viia 7 实时PCR 系统（美国Applied Biosystems）。应用ΔΔct 法计算对应比值并统计学分析。样品进行3 次重复，每个实验至少进行3次。表1为所用引物的序列信息。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.7 蛋白质Western blot检测

取20 mg冻存组织，研磨后，加入200 µL含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰上裂解15 min。4℃离心机13 300 r·min-1离心20 min，取蛋白上清后，根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒的操作说明，检测提取的蛋白浓度，加SDS 蛋白变性缓冲液，100℃，5 min。取50 µg 变性蛋白，经10% SDS-PAGE 垂直电泳、转膜、封闭后，与目的蛋白的一抗孵育（4℃过夜）后，洗脱，与相应二抗孵育（室温1 h），ECL 发光显影并定量分析。使用Image J 软件（NIH，Bethesda，MD，USA）通过光密度测定法定量条带的强度（相对蛋白水平）。

1.8 数据分析

使用GraphPad 软件分析实验数据，数据用均数±标准误来表示，各组间比较采用完全随机方法分析（One-way ANOVA），P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素显著改善LPS诱导的小鼠肝脏损伤

HE 检测显示，与对照组相比，LPS（20 mg·kg-1）腹腔注射小鼠24 h 后，小鼠肝脏组织表现出严重的病理异常（图1A），有肝脏组织结构破坏、肝组织充血、水肿、炎性细胞大量浸润。检测后发现，LPS模型组小鼠血清中ALT 和AST 的水平显著高于对照组，提示模型组织肝脏受损严重（图1B）。在给予葛根素处理后，上述肝组织病理特征和血清肝损指标，均得到显著改善，提示葛根素显著改善了LPS 诱导的肝脏组织损伤（图1）。

图1 葛根素改善LPS诱导的小鼠肝脏损伤

2.2 葛根素有效抑制LPS 诱导的小鼠肝脏组织炎症水平

随后，检测了小鼠肝脏组织中炎症相关指标的转录水平。结果显示，与对照小鼠相比，LPS诱导的肝损模型小鼠的肝脏组织中，促炎因子IL-6、TNF-α、IFNγ 的转录水平显著增加，而抗炎因子IL-10 则显著降低，在葛根素干预后，上述炎症因子水平均得到逆转，提示葛根素能有效地抑制炎症因子的产生（图2）。

图2 葛根素改善小鼠肝脏炎症状态

2.3 葛根素抑制小鼠肝脏组织中LPS 刺激引起的细胞凋亡

为了探索葛根素改善肝脏损伤的机制，首先对不同处理组小鼠肝脏组织进行细胞死亡相关分子的表达水平检测。比较发现，与正常对照组相比，LPS模型小鼠的肝组织内，细胞凋亡相关因子P53 表达显著增强（图3A），且凋亡指示蛋白cleaved-caspase3（cl.Cas3）蛋白表达水平也显著增加，提示LPS刺激肝脏细胞的凋亡产生。而葛根素干预后，模型小鼠肝脏中的P53 和cl.Cas3 的水平显著降低，提示葛根素抑制了LPS 刺激的肝脏凋亡（图3B）。上述实验结果提示，LPS 诱导肝脏细胞的过度凋亡参与肝损发生发展，葛根素干预处理可通过显著降低凋亡相关蛋白的表达水平，抑制肝脏的细胞凋亡。这提示葛根素具有良好的护肝作用。

图3 葛根素抑制小鼠肝脏组织中LPS刺激引起的细胞死亡

2.4 葛根素抑制LPS 诱导的肝脏组织中自噬过度激活

有研究发现，葛根素可通过激活PI3K/Akt 信号通路，减少肝细胞死亡来治疗小鼠的急性肝衰竭[11]，也有研究发现自噬可通过调控炎症相关因子在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型发挥作用[12]。在本实验中，本课题组检测了小鼠肝脏组织中自噬相关因子p62，Beclin1 和LC3B 的mRNA 表达水平。结果显示在LPS处理组中，LC3 和Beclin1 表达显著增加，而自噬抑制指标p62 则明显降低，提示LPS 处理后的24 h 内，肝脏组织自噬水平显著增强，可能是造成肝脏细胞死亡的原因之一。在此基础上，给予葛根素处理，可明显抑制肝组织中Beclin1 和LC3 的表达，增加p62 的表达（图4A）。与mRNA 一致，蛋白质水平检测显示（图4B），LPS 处理24 h 后，模型组小鼠肝脏自噬水平增加，表现为Beclin1和LC3蛋白水平显着增高，而p62蛋白表达则明显降低。这表明葛根素可有效地抑制LPS诱导的肝细胞自噬。

图4 葛根素抑制LPS诱导的肝脏组织中自噬蛋白过度激活

2.5 葛根素可能通过下调TLR4抑制肝脏过度自噬

最后，利用体外培养的正常人肝细胞系LO2 细胞验证体内实验结果。本课题组发现，体外LPS（100 ng·mL-14 h 后，肝细胞中TLR4 的表达水平显著增加，提示炎症激活，同时观察到自噬降解相关p62的蛋白表达水平急剧下降，LC3B 的表达水平显著增强，提示LPS 刺激24 h 后自噬水平显著增加。葛根素（20 µmol·L-1）处理后，自噬相关蛋白LC3B 的表达显著降低，而自噬降解蛋白p62的水平显著增加，这与已知TLR4 抑制剂TAK-242 处理后的效果一致，提示葛根素的作用效果和TLR4抑制剂类似，可以抑制LPS诱导的肝细胞自噬（图5）。

图5 葛根素抑制LPS刺激后自噬可能通过下调TLR4

3 讨论与结论

3.1 早期使用葛根素可治疗LPS诱导的肝脏损伤

自噬在肝稳态中发挥重要作用。有研究发现，自噬在LPS 诱导的肝损伤中被过度激活[13]。最近的报道表明，自噬可以在肝脏损伤中充当保护者或杀手，这取决于疾病所处的阶段。在起始阶段，自噬可能对肝损伤有益，有研究已经确定了这种观点[14]，即细胞自噬在脓毒症肝损伤过程中起着重要的保护作用，可通过改善微循环障碍、清除受损线粒体以及炎症因子来降低肝损程度。然而，随着疾病进展，当肝脏损伤恶化时，自噬过多可能反而加重肝坏死[15]。本课题组研究发现，LPS（20 mg·kg-1）刺激24 h 后，小鼠肝脏表现出严重的组织受损，肝组织细胞凋亡增加，伴随自噬相关蛋白被激活，在LPS 处理30 min 后，进行葛根素干预，可通过抑制肝细胞的过度自噬，从而有效抑制细胞凋亡，达到治疗的效果。本课题组发现，体外LPS 刺激后肝细胞中TLR4 的表达水平显著增加，提示炎症激活，同时观察到自噬相关LC3B 的表达水平显著增强。葛根素处理后有效逆转，这与已知TLR4抑制剂TAK-242处理后的效果一致，提示葛根素的作用效果和TLR4 抑制剂类似，可能是通过抑制TLR4，从而抑制下游炎症通路和LPS 诱导的肝细胞过度自噬。

3.2 葛根素的给药剂量及药代动力学研究

葛根素的使用剂量和给药方式也在本团队的前期研究中证实[5,16]。葛根素剂量是根据药物说明，按照动物体重计算得出。在之前发表的研究中[5,7,16]，葛根素100-160 mg·kg-1的剂量可以有效改善2型糖尿病和急性炎症模型脓毒症，均在造模期间或者模型后给药一次，提示葛根素有效的治疗效果。因此，本实验采取了100 mg·kg-1的给药剂量。在药代动力学方面，在我们发表的研究中，LPS 诱导动物急性炎症模型脓毒症的血清细胞因子显示，葛根素用后炎症因子水平变化随时间波动，且变化并非一致[16]。

3.3 葛根素作用机制的多样性

尽管已知葛根素对肝损伤具有保护作用，但大多数研究归因于其强大的抗氧化应激能力[17]，如急性酒精性肝损伤Wistar 大鼠模型的血浆和肝脏中，存在高水平的丙二醛（Malondialdehyde，MDA），用葛根素治疗5 天，可以降低相应MDA 水平[18]。利用乙醇和氯仿诱导的肝纤维化大鼠，用葛根素治疗4周，血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶，活化的肝星状细胞凋亡和Bcl-2 mRNA 的表达降低[19-20]。上述结果均提示葛根素具有显著的抗氧化应激能力，在使用一定周期后，具有明显治疗作用。

除了氧化应激，炎症也是肝脏损伤过程中的重要因素[21]。葛根素也被证实具有抗炎作用。据报道，葛根素可以减弱LPS 刺激的心肌细胞的炎症反应和凋亡[22]。LPS 刺激下的RAW264.7 巨噬细胞，p65 磷酸化增加，NF-κB核转运增强，葛根素可通过抑制p65磷酸化，减少NF-κB 核转运，从而抑制iNOS，COX-2 和C反应蛋白的表达[4,23]。在本研究中，葛根素可通过调控自噬过程，显著减少肝脏损伤模型小鼠中的促炎细胞因子表达，并增加抗炎细胞因子的水平。

3.4 局限性

本研究明确了中药葛根中单体提取物葛根素对LPS 导致肝损伤中的治疗作用。但在中医医疗活动中，遵循君臣佐使的组方原则，更多采用复方药物治疗疾病。葛根多作为其中的一种中药与其他中药共同发挥治疗作用；这种作用是多种中药在制剂过程中的综合化学反应，而并非某一单体提取物的作用。因此在含有葛根的复方药物中，葛根素发挥的治疗作用是怎样的，以及葛根素与其他组分之间的作用是怎样的，仍需我们去进一步探索。

综上，本研究表明葛根素可以改善LPS 刺激后造成的肝损伤，可通过调节自噬相关蛋白的表达水平，调控炎症相关因子表达，从而减少肝脏组织的细胞凋亡。除此之外，还需要研究葛根素与复方药物中其他组分之间的关系，以及如何共同发挥治疗作用。