肾衰泄浊汤对腺嘌呤致慢性肾衰大鼠TGF-β1/Smads通路的影响＊

李怀玉，邱丽瑛，陈 微，李玮婷，付 勇，简钰乘，杨军平＊＊

（1. 江西中医药大学研究生院 南昌 330004；2. 江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）是全球主要的公共卫生问题。预计在2040年，CKD将成为世界范围内的第5 大常见疾病死因[1-2]。一旦CKD 进入慢性肾衰竭（Chronic renal failure，CRF）阶段，透析治疗是大多数患者的治疗首选。然而透析在延长CRF患者寿命的同时，也不可避免地对患者的经济和生活质量产生一些负面影响，透析作为CRF 主要的治疗手段其实际效益并不理想[3]。

中医对CRF 的认识可追溯至《内经》[4]。病名上，参考CRF 的临床部分表现特征，可归属于中医“腰痛”和“水肿”等范畴。CRF 的基本病机为本虚标实，本虚与标实二者随病变趋势其侧重有所不同。国医大师皮持衡认为CRF 标实虽杂，但以湿浊毒邪瘀血互结为主，正虚虽累及多脏，但治疗大抵应从脾肾入手，肾衰泄浊汤便是皮持衡教授针对CRF 这一病机而设立的。该方治法上以清热化湿解毒与活血通腑泄浊为主，补益脾肾为辅，作为院内制剂有效运用于临床治疗。肾纤维化是多种肾脏疾病导致CRF 的共同表现，转化生长因子-β1（Transforming growth factor beta1，TGF-β1）作为肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis，RIF）的关键因子，其介导的TGF-β1/Smads 信号通路在肾瘢痕形成过程中起重要的调控作用[5-6]。

鉴于肾衰泄浊汤对TGF-β1/Smads 信号通路的影响尚不清楚，本实验通过构建CRF 大鼠模型，探究不同浓度肾衰泄浊汤对该通路中TGF-β1、Smad3 和Smad4 的影响，进而为肾衰泄浊汤抗RIF 的相关机制提供部分理论支持。

1 材料与方法

1.1 动物

选用SD 大鼠（SPF 级）64 只，雌雄各半，体质量180±20 g，由江西中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（赣）2018-0003。饲料充足，于室温20-25℃中适应性喂养1周。实验方案由江西中医药大学动物实验伦理委员会批准（JZLLSC20220001）。

1.2 主要药物与试剂

肾衰泄浊汤由江西省中医院药房提供，组成包括生大黄20 g、白蔻仁10 g、生牡蛎30 g、蒲公英30 g、川芎10 g、白马骨30 g和黄芪30 g等，煎煮和浓缩步骤由江西省中医院药剂科完成。腺嘌呤（北京索莱宝科技有限公司，批号：104N052）；氯沙坦钾（科素亚，杭州默沙东制药有限公司，批号：T034534）；β2-MG 试剂盒和TGF-β1检测试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司（批号均为202105）；水合氯醛（上海麦克林生化科技有限公司公司，批号：C12195151）；cDNA 合成和TB Green试剂盒均购于北京TaKaRa 公司；Smad3 抗体和Smad4抗体均购自美国CST 公司（批号均为800vlal）；引物由深圳华大基因科技有限公司合成，序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3 主要仪器

P800 型全自动生化分析仪（日本，Roche），Multiskan FC 型酶标仪（美国，Thermo Fisher），ABI 7500 型实时荧光定量PCR 仪（美国，Thermo Fisher），3K15 型4℃离心机（德国，Sigma），37XB 型倒置生物显微镜（上海，精科）。

1.4 分组、模型制备与给药

64只大鼠随机抽取12只分为正常组，剩余均采用21 天腺嘌呤灌胃法造模处理：前14 天以200 mg·kg-1剂量灌服2.5%的腺嘌呤混悬液，后7 天灌服时浓度减半。两组均保持雌雄对半。造模结束时两组均随机抽取2 只，检测血清Scr 与BUN 水平，并观察肾组织病理以判断造模状况。结果表明造模后大鼠的Scr 与BUN 水平显著高于正常组，肾组织出现大量炎性细胞浸润以及部分纤维化，初步提示造模成功。将造模后的大鼠随机分为模型组、中药9.375 g·kg-1、18.75 g·kg-1、37.5 g·kg-1组和氯沙坦钾组各10 只，每组雌雄各半。中药9.375 g·kg-1、18.75 g·kg-1、37.5 g·kg-1组分别灌胃给予相应浓度的肾衰泄浊汤，氯沙坦钾组给予1.8 mg·kg-1浓度的氯沙坦钾作为阳性对照，其余组给予生理盐水，连续28天，每日1次。

1.5 取样

第28 天给药后，大鼠进行12 h 禁食不禁水处理。麻醉后收集血液，处死后迅速摘除肾脏，肾脏均脱被膜处理。血样静置后以3000 r·min-1离心10 min，取上清液装于EP 管。肾脏取部分于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余组织和血清均置于-80℃冰箱中保存。

1.6 检测指标

1.6.1 血清Scr、BUN、β2-MG和TGF-β1含量测定

按照试剂盒说明书操作，其中Scr 采用苦味酸法，BUN采用酶法，β2-MG与TGF-β1均采用ELISA法。

1.6.2 肾组织HE染色病理形态观察

已固定的肾组织经脱水、包埋、切除处理后，实施HE染色，在显微镜下观察肾组织的病理变化。

1.6.3 RT-PCR 法测定肾组织中Smad3 与Smad4 的mRNA表达水平

TRIzol 法提取肾组织总RNA，进行RNA 浓度及纯度测定。对RNA 进行去除基因组DNA 以及逆转录处理合成cDNA，逆转录条件设定：37℃ 15min，85℃ 5 s，4℃保持。PCR 扩增反应体系为20 µL，反应条件设定：95℃ 30 s 预变性处理，两步法（95℃ 5 s、55℃ 40 s）循环40 次，融解曲线分析。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算Smad3与Smad4的相对含量。

1.6.4 Western blot 法测定肾组织中Smad3 与Smad4的蛋白表达水平

RIPA 裂解液提取肾组织总蛋白，通过BCA 法测定蛋白浓度。蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液，上样蛋白量为20 µg。基于SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，再电转至NC 膜上。5%的脱脂奶粉封闭1 h 后，加入Smad3 与Smad4 对应的一抗4℃孵育过夜。洗涤后加入二抗室温孵育1 h，之后再次洗涤。现配ECL 化学发光液进行显影处理，以GAPDH 为内参，采用Image J 软件进行Smad3 与Smad4 目的条带光密度值分析。

1.7 统计学处理

统计分析采用SPSS 26.0 和Prism Graphpad 8.2.1软件，实验数据以均值±标准差（）表示。组间差异比较选用独立样本t检验（两组）或单因素ANOVA 分析（两组以上），Kruskal-Wallis检验用于两组以上数据且方差不齐。事后比较中，若方差齐选用LSD 检验，不齐选用Tamhane’sT2 检验。以P＜0.05，P＜0.01 时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾衰泄浊汤对CRF 大鼠血清Scr、BUN 和β2-MG水平的影响

与正常组相比，模型组大鼠血清中Scr、BUN 和β 2-MG 水平均显著升高（P＜0.01），且三者在雄、雌鼠间差异不明显。与模型组相比，Scr 在各浓度中药组中均出现显著下降（P＜0.01）；BUN 与β2-MG 除中药9.375 g·kg-1组改善不明显以外，中药18.75 g·kg-1与37.5 g·kg-1组均显著下降（P＜0.01）。与氯沙坦钾组相比，Scr、BUN 和β2-MG 含量在中药18.75 g·kg-1与37.5 g·kg-1组中均无明显差异（见表2）。

表2 肾衰泄浊汤对CRF大鼠血清中Scr、BUN和β2-MG水平的影响

2.2 肾衰泄浊汤对CRF大鼠肾组织病理的影响

正常组大鼠肾组织肾小球和肾小管排列整齐、形态完整，间质内无明显炎性细胞浸润与纤维病变；造模后肾小管排列无规则，出现不同程度扩张，伴有大量棕褐色代谢产物沉积，肾小球变形萎缩，数量减少，肾间质大量炎性浸润，伴纤维化增生。各浓度中药干预后，较模型组而言，CRF 大鼠肾组织的炎性浸润、纤维化增生以及代谢产物沉积状况均有所改善（见图1）。

图1 肾衰泄浊汤对CRF大鼠肾组织病理的影响（200×）

2.3 肾衰泄浊汤对CRF 大鼠血清TGF-β1 水平的影响

与正常组相比，模型组大鼠血清中TGF-β1 水平均显著升高（P＜0.01），雄鼠显著高于雌鼠（P＜0.05）。与模型组相比，TGF-β1 在各浓度中药组中均出现不同程度的降低，其中以中药18.75 g·kg-1与37.5 g·kg-1组的改善具有统计学意义（P＜0.01）。中药18.75 g·kg-1与37.5 g·kg-1组与氯沙坦钾组相比无明显差异（见表3）。

表3 肾衰泄浊汤对CRF大鼠血清中TGF-β1水平的影响

2.4 肾衰泄浊汤对CRF 大鼠肾组织Smad3 与Smad4的mRNA表达影响

与正常组相比，模型组大鼠肾组织中Smad3 与Smad4 的mRNA 表达均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，Smad3 与Smad4 的mRNA 表达在各浓度中药组和氯沙坦钾组中均出现不同程度的降低，Smad3 在各浓度中药组中的改善均具有统计学意义（P＜0.01），Smad4在中药组中以18.75 g·kg-1组（P＜0.05）与37.5 g·kg-1组（P＜0.01）的改善具有统计学意义。中药37.5 g·kg-1组和氯沙坦钾组相比Smad3与Smad4的mRNA表达均无明显差异（见图2）。

图2 肾衰泄浊汤对CRF大鼠肾组织Smad3与Smad4的基因表达影响（n=36）

2.5 肾衰泄浊汤对CRF 大鼠肾组织Smad3 与Smad4的蛋白表达影响

与正常组相比，模型组大鼠肾组织Smad3 与Smad4的蛋白表达均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，各浓度中药组中Smad3 与Smad4 的蛋白表达均出现下调，Smad3 与Smad4 的蛋白表达在中药组中均以18.75 g·kg-1组（P＜0.01）与37.5 g·kg-1组（P＜0.01）改善具有统计学意义。与氯沙坦钾组相比，中药37.5 g·kg-1组Smad3 的蛋白表达无明显差异，中药18.75 g·kg-1与37.5 g·kg-1组Smad4的蛋白表达无明显差异（见图3）。

图3 肾衰泄浊汤对CRF大鼠肾组织Smad3与Smad4的蛋白表达影响（n=12）

3 讨论与结论

肾衰泄浊汤作为国医大师皮持衡针对CRF 而设立的主方，全方以祛邪为主：方中投川芎以辛温走散，通阳活血使瘀血能祛；予白豆蔻燥湿而走中，大黄、猪苓通浊利尿而走下，分消走泄使得湿毒能化；加蒲公英等苦寒清热，利湿解毒使湿热能去；添牡蛎咸入肾、黄芪甘入脾以益脾肾，以防攻邪伤正之患。前期研究中，肾衰泄浊汤被证实可减缓CRF 大鼠肾脏微血管毁坏，提高免疫保护；减轻受损肾小球内皮细胞炎症反应，抑制TGF-β 和结缔组织生长因子的表达[7-9]，这提示肾衰泄浊汤治疗CRF 的机理可能与干预TGF-β 相关通路有关。

3.1 肾衰泄浊汤对CRF 大鼠肾组织病理及肾功能的影响

本研究采用腺嘌呤灌胃复制CRF 大鼠模型，这种造模方式的机理在于高浓度的腺嘌呤可经肝脏转换成2,8-二羟基腺嘌呤，后者难溶于水，易机械性累积于肾小管形成结晶引发持续性梗阻，终而导致CRF。与正常大鼠相比，造模大鼠肾组织HE 染色后表现出明显的肾小球和肾小管结构异常，小管内布满大量的2,8-二羟基腺嘌呤结晶，间质内出现大量炎性浸润以及部分纤维化病变，并伴随着血清中Scr、BUN 表达水平的显著升高，这表明造模后大鼠的肾脏结构受损情况显著。与模型组相比，肾衰泄浊汤能改善肾组织的病理变化，显著降低CRF 大鼠血清中的Scr、BUN 含量，且降低程度与肾衰泄浊汤的浓度成正向关系。

β2-MG 作为一种潜在的内源性滤过标志物被广泛报道[10]。正常情况下，血清中的β2-MG 经过肾小球，在近端小管中以重吸收和分解代谢的方式进行转换。一旦肾小球滤过率出现降低，β2-MG 的不断堆积会使得其在血清中的含量明显增加，检测血清中β2-MG 的含量变化可有效评估肾小球的滤过效率[11]。与Scr、BUN 趋势一致，本研究中CRF 大鼠血清的β2-MG含量均出现了显著增加，而肾衰泄浊汤能较好地降低其在血清中的含量，且18.75 g·kg-1与37.5 g·kg-1浓度的肾衰泄浊汤对CRF 大鼠血清中的β2-MG、CysC 含量改善与氯沙坦钾相比均无显著差异。

3.2 肾衰泄浊汤对CRF大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响

RIF 是肾功能不全的主要决定因素，代表着几乎所有CKD 导致的CRF 共同特征表现，而TGF-β 是肾纤维化驱动的主要因素之一[12]。成熟的TGF-β 通过非共价方式与潜伏相关肽（Latency-associated peptides，LAP）相关联，然后与充当定位作用的TGF-β结合蛋白（Latent TGF-β binding proteins，LTBP）相附着，稳定地存在于细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）中。作为哺乳动物的三种TGF-β 亚型之一，TGF-β1 是肌成纤维细胞活化的主要介质[13]。在LAP的抑制作用下，TGF-β1/LAP/LTBP复合物中的TGF-β1处于长期的非活性状态[14]。然而，一旦肾脏持续受损，潜伏的TGF-β1复合物在多种酶的裂解作用下释放出大量活化的TGF-β1。本次研究中，CRF 大鼠模型血清中的TGF-β1 含量出现显著升高，这些活化的TGFβ1 可与TGF-β 受体2 结合，进一步激活TGF-β 受体1以触发细胞内下游的信号通路传导[12]。TGF-β1/Smads 信号通路是目前公认的典型TGF-β1 促纤维化通路。在活化TGF-β 受体1 的作用下，Smad2、Smad3与Smad4 结合形成Smads 复合物，共同调控纤维化前分子的转录，从而触发ECM 积累以及肌成纤维细胞激活的相关生物效应。Smad2、Smad3与Smad4在肾纤维化的调节过程中扮演着不同的角色，三者的显著区别在于Smad3 可直接与基因启动子中的相关元件结合以促进转录，而没有DNA 结合域的Smad2 和Smad4 的效应发挥是建立于其对Smad3的调节基础[15]。本研究结果表明，腺嘌呤灌胃致CRF 大鼠肾组织中的Smad3与Smad4 表达均出现显著上调，这一结果与其他研究的认识基本一致[16-17]。在肾衰泄浊汤的干预下，大鼠血清中的TGF-β1含量、肾组织中Smad3与Smad4的基因和蛋白表达水平均显现出不同程度的改善：TGF-β1含量方面，肾衰泄浊汤中以18.75 g·kg-1和37.5 g·kg-1组改善显著；Smad3 与Smad4 的mRNA 表达方面，Smad3在各浓度肾衰泄浊汤中均改善显著，而Smad4 在肾衰泄浊汤中以18.75 g·kg-1和37.5 g·kg-1组改善显著；蛋白表达方面，Smad3 与Smad4 在肾衰泄浊汤中均以18.75 g·kg-1和37.5 g·kg-1组改善显著。由此可见，肾衰泄浊汤在抗RIF 的机制涉及到TGF-β1/Smads 信号通路的转导，并可能与TGF-β1、Smad3 和Smad4 的抑制有关。

综上所述，肾衰泄浊汤能降低腺嘌呤灌胃造模大鼠血清中的Scr、BUN和β2-MG含量以改善肾脏功能，抑制炎性浸润、纤维化增生和代谢产物沉积以减轻肾组织病理损伤，其对肾脏的保护机制可能与降低血清中的TGF-β1 含量以及下调肾组织中的Smad3、Smad4表达而改善RIF 有关。然而，肾纤维化形成是一个复杂的过程，肾衰泄浊汤对TGF-β1 相关通路的影响还待后续研究以进一步分析。