川陈皮素对慢传输型便秘小鼠的治疗作用及机制研究＊

黄 礼，韦 祎，刘英莲＊＊

（1. 海口市第三人民医院 海口 571100；2. 海南医学院中医学院 海口 571199）

慢传输型便秘（Slow transit constipation，STC）是一种以结肠运动功能障碍为特点的肠道疾病，伴有肠内容物在结肠上传输缓慢，粪便次数减少且干燥等临床现象[1]。由于现代饮食、生活习惯等方式的多样，导致STC患病率高居不下，使患者的生活质量变差，经济负担加重，严重时可引起肠道危重急病，危害生命，而且病因和发病机制目前尚不明确，因此STC 的临床治疗和机制研究刻不容缓。有研究显示，STC 可能与肠神经系统（Enteric nervous system，ENS）、胃肠道Cajal 间质细胞（Interstitial cell of Cajal，ICCs）和平滑肌细胞组成的肠运动调控有关，ENS 或ICCs 失调可导致平滑肌松弛，引起结肠运动减弱，促成STC 疾病的产生，而调节ENS 和ICCs，可改善STC[2]。干细胞因子/酪氨酸激酶受体（Stem cell factor-C-kit，SCF/C-kit）信号通路在疼痛感知、胃肠动力紊乱和炎症异常激活中均有重要作用，参与STC 中ENS 和ICCs 失调[3]。推测，STC 主要的发病机制可能是SCF/c-kit 信号通路。众多研究发现STC 治疗方式常以西药为主，长期服用可引起心血管、内分泌等系统的不良反应，因此寻找一种高效且低毒副作用的治疗药物成为最新研究方向[1-3]。中医药作为新型研究项目，在治疗胃肠疾病方面效果显著，有很多中药单体均表现出强有力的治疗效果并且副作用小。中药陈皮具有治疗胸腹胀满、脾虚饮食减少、消化不良以及恶心呕吐等疾病，常与其他药材同用达到通润肠道治疗便秘的作用，而川陈皮素（Nobiletin，NOB）作为从陈皮分离出的一种黄酮类化合物，具有抗真菌、抗炎作用，可双向调控大鼠空肠段平滑肌的收缩性，促进胃肠动力[4-5]。说明NOB针对胃肠蠕动具有一定的科学依据，但NOB 对STC 是否有治疗作用尚未可知，并且具体的治疗机制也不明确。因此，本研究通过构建STC 小鼠模型，探讨NOB 对STC小鼠结肠运动功能的影响及其作用机制，为临床开发治疗STC相关药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠72只，雌性，8周龄，体质量25-28 g，购自华中农业大学，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2020-0019。小鼠于SPF 条件下饲养，温度（24±1）℃，相对湿度50%-55%，明暗光照各12 h，适应性饲养7天。

1.2 实验试剂及仪器

盐酸洛哌丁胺购自美国sigma 公司；川陈皮素（纯度＞98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；莫沙必利、活性炭、阿拉伯树胶粉购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；小鼠5-羟色胺（5-HT）、血管活性肽（VIP）和一氧化氮合酶（NOS）ELISA 试剂盒购自武汉华美生物有限公司；小鼠一氧化氮（NO）ELISA 试剂盒购自上海心语生物科技有限公司；SCF 抗体、c-kit 抗体和β-actin抗体购自英国Abcam公司；电泳仪（型号：164-5050）美国BIO-RAD 公司；正置显微镜（型号：DM4B）购自德国徕卡公司；全功能酶标仪（型号：SpectraMax iD3）购自美国Molecular Devices 公司。生物机能实验系统（型号：BL-420F）购自长春添月科技有限公司；自制银丝电极，直径0.4 mm，长12 mm。

1.3 实验方法

1.3.1 STC模型构建及分组

将KM 小鼠随机分为正常组（CON）、模型组（MOD）、阳性对照组（PC）和NOB 低（NOB-L）、中（NOB-M）、高剂量（NOB-H）组，每组12 只。除CON组外，其余组小鼠均采用盐酸洛哌丁胺诱导STC 小鼠模型[6]：小鼠按照3 mg·kg-1·d-1剂量灌服盐酸洛哌丁胺，每天2次（9∶00和17∶00），连续14天。检测造模后各组小鼠排便量及粪便含水量情况，若造模后数据明显低于造模前，确定STC 小鼠建模成功[6]，剔除造模不成功的小鼠并及时补充。造模成功后，NOB-L、NOBM 和NOB-H 组小鼠给予10、20、40 mg·kg-1·d-1的NOB灌胃，PC 组小鼠给予2.5 mg·kg-1·d-1莫沙必利灌胃，CON 组和MOD 组小鼠给予等量生理盐水，每天1 次，共2周。

1.3.2 排便量和粪便含水量测定

在造模前、造模后及药物干预后3个时间点，将各组小鼠置于代谢笼中自由饮水活动24 h，收集小鼠粪便，统计排便量并称重记录，随后将粪便放入65℃烘箱中烘干6 h 后称取干重，计算其含水量。粪便含水量（%）=（粪便湿重-粪便干重）/粪便湿重×100%。

1.3.3 活性炭推进实验检测肠道传输功能

药物干预结束后，各组小鼠按照0.1 mL·10 g-1剂量灌胃活性炭混悬液（浓度为：100 g·L-1，配置方法：称取阿拉伯树胶粉50 g，加水400 mL，煮沸至溶液透明，称取活性炭25 g 加入上述溶液中煮沸3 次，待溶液凉后加水定容至500 mL）；灌胃完30 min 后，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉各组小鼠，沿腹部中线切开腹腔，暴露全部肠道，在松弛状态下测量从幽门到直肠末端肠道的全长及活性炭混悬液在肠道内推进的长度，并计算肠道推进率。肠道推进百分率（%）=（活性炭前端与幽门的距离/肠道全长）×100。

1.3.4 结肠肌电测定

活性炭推进实验结束后，小鼠仰卧于手术台上，在距离盲肠约1.5 cm 结肠浆肌层内植入两根银丝电极，两者相距约0.5 cm，同时引入BL-420F生物机能实验系统，0.5 h 后开始测定，灵敏度选择：标准电压1 mV·cm-1，时间常数1 s，高频滤波1 Hz，连续记录1 h。将各组结果每180 s 作为一个时间单位，并计算出该时间内慢波频率和振幅的均数、标准差和变异系数；变异系数（%）=（标准差/均数）×100。

1.3.5 HE染色

取各组小鼠结肠组织1 cm，采用4%甲醛固定，剩余结肠组织采用PBS 冲洗干净后装入冻存管-80℃保存。取已固定24 h 的结肠组织，放入由低到高浓度乙醇除去组织水分，以二甲苯替换组织中的酒精，浸蜡包埋冷却凝固成蜡块；将蜡块切成薄片（厚5 µm）、展片、置于载玻片上45℃烘干；制备好的石蜡切片经脱蜡、至水、苏木精水溶液-酒精伊红溶液分批染色，再次脱水、透明，中性树胶封固。切片于显微镜下观察结肠组织病理形态变化。

1.3.6 ELISA 法检测结肠组织中5-HT、VIP、NO 和NOS水平

取100 mg 结肠组织放入0.9 mL 预冷的PBS（pH=7.4）置于匀浆机中充分研磨均匀，3000 r·min-1离心20 min，取20 µL 上清，按照ELISA 试剂盒说明书进行加样、室温温育、洗板，最后在波长450 nm 处进行比色读数，测定结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平。

1.3.7 Western blot 检测结肠组织中c-kit 和SCF 蛋白表达

取适量结肠组织，采用RIPA 裂解液抽提组织蛋白，使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。取25 µg 蛋白样品与SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液混合，100℃加热5 min 充分变性蛋白，电泳1.5 h 分离蛋白，切胶、剪膜、滤纸、转PVDF 膜，室温封闭1 h，依次加入c-ki（t1∶1000）、SCF（1∶1000）和内参β-actin（1∶1000）抗体，4℃孵育过夜。次日，TBST 洗脱3 次，加入稀释过的HRP 标记的二抗（1∶10000）室温孵育1 h，TBST洗脱3 次，按照ECL 化学发光检测试剂盒说明书进行显影拍照。采用Image J软件计算各个蛋白灰度值，计算出目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/内参β-actin的灰度值。

1.3.8 数据处理

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量数据以均值±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 NOB对小鼠排便量和粪便含水量的影响

由表1 和表2 可知，各组小鼠造模前24 h 排便量和粪便含水量无显著差异（P＞0.05），造模后，与CON组比较，MOD、PC、NOB-L、NOB-M、NOB-H 组小鼠24 h 排便量和粪便含水量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明出现STC疾病现象，即粪便次数减少且干燥；经药物干预后，与CON 组比较，MOD 组小鼠排便量和粪便含水量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MOD 组比较，PC、NOB-M、NOB-H 组小鼠排便量和粪便含水量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且PC 和NOB-H 组更显著，而NOB-L 组小鼠以上检测无显著差异（P＞0.05）。提示NOB 对STC 小鼠的排便情况有缓解作用，且缓解程度与给药剂量呈正比。

表1 各组小鼠各时间点24 h排便量变化（，n=12）

表1 各组小鼠各时间点24 h排便量变化（，n=12）

注：与CON组比较，*P＜0.05；与MOD组比较，#P＜0.05。

?

表2 各组小鼠各时间点24 h粪便含水量变化（，n=12）

表2 各组小鼠各时间点24 h粪便含水量变化（，n=12）

注：与CON组比较，*P＜0.05；与MOD组比较，#P＜0.05。

?

2.2 NOB对小鼠肠道推进率的影响

与CON 组比较，MOD 组小鼠肠道推进率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MOD 组比较，NOB-L 组小鼠肠道推进率无显著性差异（P＞0.05），而PC、NOBM、NOB-H 组小鼠肠道推进率升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中PC 和NOB-H 组肠道推进率最高。表明NOB可有效促进肠道推进，加快排便。见表3。

表3 NOB对小鼠肠道推进率的影响（，n=12）

表3 NOB对小鼠肠道推进率的影响（，n=12）

注：与CON组比较，*P＜0.05；与MOD组比较，#P＜0.05。

?

2.3 NOB对小鼠结肠肌电慢波活动的影响

如表4所示，与CON 组比较，MOD 组小鼠频率、频率变异系数和振幅变异系数升高，振幅降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MOD 组比较，PC、NOB-M、NOB-H组小鼠频率、频率变异系数和振幅变异系数降低，振幅升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而NOB-L组小鼠以上检测无显著性差异（P＞0.05），PC 和NOBH 组结肠肌电效果最佳，说明NOB 具有增强结肠肌电活动的能力。

表4 NOB对小鼠结肠肌电慢波活动的影响（，n=12）

表4 NOB对小鼠结肠肌电慢波活动的影响（，n=12）

注：与CON组比较，*P＜0.05；与MOD组比较，#P＜0.05。

?

2.4 NOB干预后小鼠结肠组织病理变化

如图1所示，CON组结肠组织黏膜层完整，杯状细胞形态和数量正常。MOD 组结肠组织肌层变薄，黏膜层破损，腺体腔变窄、杯状细胞减少，并且固有层及黏膜下层有大量炎症细胞浸润；NOB-L 组结肠组织病理变化与模型组相似，出现明显的腺体腔变窄、杯状细胞减少现象。与模型组比较，PC、NOB-M、NOB-H 组结肠组织有所改善，且PC、NOB-H 组改善最为明显，表现为肌层变厚，杯状细胞和腺体腔恢复正常，无炎症细胞浸润，基本接近于CON 组；而NOB-M 组结肠组织肌层比PC、NOB-H 组肌层薄，存在少数腺体腔变窄。

图1 各组小鼠结肠组织病理学变化（HE，100×）

2.5 NOB对小鼠结肠组织5-HT、VIP、NO和NOS水平的影响

如表5 所示，与CON 组比较，MOD 组小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO 和NOS 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MOD 组比较，PC、NOB-M、NOB-H组小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO 和NOS 水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），其中PC 和NOB-H 组小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO 和NOS 水平降低更明显，而NOB-L 组小鼠以上检测无显著性差异（P＞0.05）。说明NOB 可降低STC 小鼠结肠组织中肠神经递质的活性。

表5 NOB对小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平的影响（，n=12）

表5 NOB对小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平的影响（，n=12）

注：与CON组比较，*P＜0.05；与MOD组比较，#P＜0.05。

?

2.6 NOB对小鼠结肠组织中c-kit、SCF表达的影响

如图2 所示，与CON 组比较，MOD 组小鼠结肠组织中c-kit 和SCF 蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MOD 组比较，PC、NOB-M、NOB-H 组小鼠结肠组织中c-kit和SCF 蛋白水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中NOB-H 组c-kit 和SCF 蛋白水平最高，而NOB-L 组小鼠以上检测无显著性差异（P＞0.05）。

图2 各组小鼠结肠组织中SCF/c-kit信号通路相关蛋白表达水平

3 讨论

NOB 是从芸香科川橘、酸橙、柑橘等果皮、叶和茎中提取出的一种多甲氧基黄酮类化合物，因其具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗诱变等多种生物活性而引起关注，但近几年研究发现NOB 在治疗肠道疾病上也有重大作用，例如，研究证实，NOB通过抑制NF-κB信号通路的表达，减少肠道内NOS、炎症因子等含量，诱导肠平滑肌收缩和肠动力平衡，从而减轻炎症性肠病引起的腹泻；NOB还可影响肠道微生物的组成和活性，促进肠道对物质的吸收，增强肠道蠕动[7-8]。Wu等[9]研究显示，NOB对结肠组织中NO呈剂量依赖性抑制。但NOB在STC 疾病中是否有治疗作用，目前尚未见文献报道。本研究结果发现，NOB 对STC 的治疗作用与药物剂量呈正比，高剂量NOB 所得结果与莫沙必利结果一致，表示高剂量NOB的有效性；即高剂量NOB可能通过上调SCF和c-kit蛋白表达，降低结肠组织中神经递质的含量，增强STC小鼠结肠肌电活动和肠道推进，从而减轻结肠损伤，改善排便障碍，达到治疗STC的效果。

临床试验中STC 疾病女性发病率高于男性，并且雌性小鼠采用洛哌丁胺诱导便秘效果最佳[10-12]。因此本研究采用雌性小鼠通过盐酸洛哌丁胺诱导STC 小鼠模型，结果显示，STC 小鼠排便量、粪便含水量和肠道推进率明显降低，结肠组织损伤显著，与姚一博等[13]研究一致，呈明显的结肠功能障碍，表明STC 小鼠模型构建成功。进一步研究发现STC 小鼠结肠肌电活动、肠神经传递及结肠中SCF和c-kit蛋白表达均发生变化。

结肠肌电运动与ICCs 有关。ICCs 作为肠道起搏器，在肠道内产生电振荡，引起平滑肌收缩从而波动结肠肌电慢波（慢波）[14-15]。夏旭婷等[16]研究表明，STC小鼠可引起Ca2+浓度降低，ICCs数量减少，慢波电流大量产生，导致慢波频率升高，振幅降低，慢波波形紊乱，使邻近的平滑肌细胞产生不协调的收缩，从而引起结肠运动障碍。本研究结果显示，NOB-H组小鼠排便量、粪便含水量和肠道推进率明显升高，结肠组织损伤减轻，提示STC 有所改善。同时，NOB-H 组小鼠慢波频率、频率和振幅的变异系数明显降低，振幅明显升高。说明NOB 可调节STC 小鼠的结肠肌电，进而影响平滑肌收缩的节律，促进结肠运动，改善结肠功能障碍，加快排便。

SCF 和c-kit 蛋白可调控肠道神经的传递[17]。SCF结合c-kit 激活各种细胞信号的级联反应，促进ICCs细胞增殖生长；而ICCs 作为肠神经递质作用的靶细胞，可调节ENS 中多种肠神经递质（例如：5-HT、VIP、NO）表达和信号传导，引起肠神经传递，从而影响肠道平滑肌运动[18]。其中5-HT、VIP、NO 等肠神经递质均与肠蠕动相关。肠神经递质受到刺激时，5-HT 作用于肠神经元释放VIP、NO，VIP 和NO 作为抑制性神经递质，影响肠道蠕动反射和平滑肌的舒张；而过量的NO 可导致肠道平滑肌细胞内Ca2+浓度减少，使肠道平滑肌过度舒张，出现肠痉挛现象[19]。NOS是合成NO的限速酶，研究指出，便秘小鼠肠道中NOS 活性被抑制时，可减少NO 的生成，缓解便秘[20]。众多研究表明，STC 可下调SCF/c-kit 信号通路，结肠组织中5-HT、VIP、NO、NOS含量升高，对胃肠道呈下行性抑制，ICCs和ENS 损害，肠神经传递减弱，胃肠蠕动缓慢，肠道代谢紊乱，产生便秘[21-22]。本研究结果显示，NOB-H 组小鼠结肠组织中c-kit 和SCF 蛋白水平明显升高，5-HT、VIP、NO、NOS 水平明显降低，说明NOB 通过上调SCF 和c-kit 蛋白表达，降低肠神经递质活性，增强肠神经传递能力，从而调节肠道运动。

4 结论与创新

NOB 通过调节结肠肌电、增强肠道神经传递、促进肠道推进，从而改善STC 小鼠排便情况，其作用机制可能与上调SCF 和c-kit 蛋白表达有关。由于本研究没有加入SCF/c-kit信号通路抑制剂（ISCK03），故无法确定是通过影响SCF/c-kit信号通路来调控，后续还需进一步验证。此外，关于治疗STC 的中医药较多，但NOB 治疗STC 的研究从未有过先例，本研究首次揭示NOB 对盐酸洛哌丁胺所致小鼠STC 的缓解作用，并科学阐释其作用机制，对于NOB 在胃肠动力异常的临床运用上具有重要意义。