基于NETs探讨三七总皂苷干预动脉粥样硬化伴急性心肌损伤的效应及机制研究＊

杨祯妮，李深广，陈 瑜，2，熊敏琪，2＊＊，张 腾，2＊＊

（1. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 上海 200437；2. 上海市中医药研究院中西医结合临床研究所 上海 200437）

近年来，全球心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）患病率和死亡率显著上升，2020年12月JACC发表的《全球心血管疾病和危险因素负担1990-2019》显示[1]，全球CVD 患病人数从1990 年的2.71 亿增加到2019 年的5.23 亿，CVD 死亡人数从1990 年的1210 万增加到2019 年的1860 万。目前，CVD 是全球的主要死亡原因，占全球所有死亡人数的1/3，而AS导致的死亡占CVD总死亡的3/4[2-3]。

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是CVD 的主要病理基础，AS的发展往往伴随着动脉狭窄导致的心肌缺血缺氧，临床上AS 伴急性心肌损伤是最常见的情况，多靶点积极治疗方案对于降低AS 致残致死率具有重要意义。

中性粒细胞是人体数量最多的天然免疫效应细胞，最先被招募于炎症部位。中性粒细胞除了经典的吞噬、脱颗粒作用以外，还可以通过NETosis 形式释放中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps，NETs）捕获并杀伤病原体。NETs 已证实参与AS 始动和调控环节，NETs 激活巨噬细胞，分泌细胞因子白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β），从而激活了辅助性T 细胞17（TH17），扩大了免疫细胞在粥样硬化灶的聚集，最后引起慢性炎症反应[4]。目前研究提示NETs 加重急性心肌损伤，与急性心肌梗死的不良预后存在明显的相关性。研究表明NETs 通过ROS 依赖性途径形成大量NETs 加重小鼠急性心肌损伤，并且，通过输注脱氧核糖核酸Ⅰ（Deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）降解NETs 后，缺血再灌注的损伤心肌得到改善。然而，NETs在急性心肌梗死中的作用及机制尚未完全阐明，尽管面临挑战，NETs 的研究在CVD 中的新见解有望为AS伴急性心肌损伤的治疗提供新的途径。

三七又名田七，五加科人参属植物，是中药宝库中的一颗明珠，明代著名药学家李时珍称其为“金不换”。清代药学著作《本草纲目拾遗》中记载“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药中之最珍贵者”。三七具有化瘀止血、活血定痛的功效，是中华名贵药材，在经方中有400多年的历史，其在心血管系统的用药价值得到广泛的关注和认可。

PNS作为三七主要活性成分，其在AS中的作用得到广泛认可，本课题组前期研究提示PNS 组具有显著抗AS斑块形成和减轻斑块组织炎症等作用[5-6]，随着研究的深入，本文进一步从NETs这一炎症始动因素为切入点，探讨PNS对AS伴急性心肌损伤的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6J小鼠为背景的ApoE-/-小鼠21只，体质量（19±2）g，8 周龄，SPF 级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（苏）2010-0001。饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物实验中心，动物伦理审批号：YYLAC-2020-079-2-3。在温度18-22℃，相对湿度35%-55%环境中给予光照（12 h）/暗室（12 h）交替。

1.2 药物与试剂

PNS（纯度≥98%）（批号：D339879）：购于上海泛亚生物医药集团；0.9% 生理盐水注射液（批号：D21071702）：购于华裕（无锡）制药有限公司。ISO（纯度≥99%）：购于东京化成工业株式会社（TCI）。Ly6G抗体（批号：551461）：购于美国BD Biosciences 公司。MPO 抗体（批号：PA5-16672）：购于美国Thermo Fisher公司。Cit-H3 抗体（批号：ab5103）：购于美国Abcam公司。山羊抗兔小鼠二抗（批号：8890s）：购于美国Cell Signaling Technology 公司。驴抗兔二抗（批号：ab150073）购于：美国Abcam公司。

1.3 主要仪器

冰冻切片机（型号：CM3050S）、正置荧光显微镜（型号：DM6000B）、正置显微镜（型号：DM2000），德国Leica 公司；电子天平（型号：FA1004B），上海精密科学仪器有限公司；组织脱水机（型号：TP1020），组织包埋机（型号：EG1150C），石蜡切片机（型号：RM2235），冰冻切片机（型号：CM3050S），德国Leica公司。

1.4 体内实验

所有实验动物用普通饲料适应性喂养1 周后，按随机数字表法将其分为3 组，每组7 只。分别为ApoE-/-组、ISO 组、PNS 组。从动物8 周龄开始，PNS 组腹腔注射200 mg·kg-1·d-1，溶于0.9%生理盐水，每只100 µL，ISO 组和ApoE-/-组给予等体积生理盐水，每天定点给药，连续8周，同时所有动物给予高脂饲料加速AS 发病过程。所有小鼠连续给药8 周后ISO 组、PNS组叠加腹腔注射ISO（溶于0.9%生理盐水）10 mg·kg-1，每只100 µL，每天定点注射1 次，连续5 天，并观察统计动物死亡数据。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 主动脉根部斑块病理检测

动物处死，分离主动脉及心脏，心房连同主动脉根部用OCT 包埋，液氮速冻，转入-80℃冰箱保存，使用冰冻切片机将冰冻组织制成10 µm冰冻切片。采用HE 染色法观察，冰冻切片经苏木素浸染、伊红浸染、梯度乙醇脱水、中性树脂封固后在正置显微镜下观察。观察斑块的组织结构，采用Image Pro Plus 6.0 软件分析，测量斑块/血管腔面积比，并计算平均值。采用油红O 染色法观察，冰冻切片经60%乙醇分化，取油红饱和液滴染5-10 min 后，60%乙醇分化后苏木素复染核，水洗、甘油明胶封片。在正置显微镜下观察，采用Image Pro Plus 6.0 软件分析，测量脂质沉积面积/斑块面积比，并计算平均值。

1.5.2 心肌组织病理检测

切割下心室部分采用4%多聚甲醛浸泡固定，蒸馏水冲洗后进行脱水、浸蜡、包埋，制成4 µm 连续切片。采用HE 染色法观察，石蜡切片经脱蜡至水、苏木素浸染、伊红浸染、梯度乙醇和二甲苯脱水、中性树脂封片后，正置显微镜随机取5 个以上视野测量病变部位，采用Image Pro Plus 6.0软件分析，测量心肌损伤部位面积，并计算平均值。采用天狼星红染色法观察，石蜡切片经脱蜡至水、苏木素浸染、天狼星红浸染、梯度乙醇和二甲苯脱水、中性树脂封片。正置显微镜随机取5 个以上视野测量病变部位，采用Image Pro Plus 6.0 软件分析，进行心肌组织胶原容积分数（CVF）分析,CVF=胶原面积/总面积。并计算平均值。

1.5.3 主动脉根部斑块MPO、Ly6G抗原活性

采用免疫组织化学法检测。将斑块冰冻切片用TBS 清洗后，5% BAS+10%山羊血清+10%驴血清封闭，滴加一抗鼠Ly6G（1∶1000）单克隆抗体，滴染荧光二抗山羊抗小鼠（1∶1000），滴加复染一抗兔MPO（1∶500），滴染荧光二抗驴抗兔（1∶1000）。正置荧光显微镜荧光激发成像并观察记录，采用Image Pro Plus 6.0软件分析计算斑块部位目的抗原平均荧光强度。

1.5.4 心肌组织Ly6G、Cit-H3抗原活性

采用免疫组织化学法检测。将心肌石蜡切片常规脱蜡复水、抗原修复、5% BAS+10%山羊血清+10%驴血清封闭，滴加一抗Cit-H3 单克隆抗体（1∶1000），荧光二抗驴抗兔（1∶1000），复染一抗Ly6G 单克隆抗体（1∶500），滴染荧光二抗山羊抗小鼠（1∶1000）。正置荧光显微镜荧下观察，采用Image Pro Plus 6. 0 软件分析计算心肌部位目标抗原平均荧光强度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件分析。实验数据为计量资料均符合正态分布，以均值±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PNS 组对ApoE-/-小鼠主动脉斑块形成的抑制作用

ApoE-/-组和ISO 组小鼠主动脉内膜出现大量斑块（图1），经过比较斑块/管腔相对面积，与ApoE-/-组相比，ISO 组斑块相对面积未见明显差异（P＞0.05）。与ApoE-/-组和ISO 组相比，PNS 组均能显著减小斑块面积，差异具有统有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组小鼠主动脉H&E染色（×50）

2.2 PNS 组对ApoE-/-小鼠主动脉脂质沉积的抑制作用

ApoE-/-组和ISO 组小鼠主动脉斑块部位出现大量脂滴沉积（图2），比较量化后脂质/斑块面积相对值，PNS 组与ApoE-/-组和ISO 组比较，PNS 组均能显著减少斑块上的脂质沉积，有统计学意义（P＜0.05）。

图2 各组小鼠主动脉根部油红O染色（×50），局部放大图片（×200）

2.3 PNS 组对ApoE-/-小鼠心肌纤维化形成的抑制作用

与ApoE-/-组相比，ISO 组小鼠心肌组织可见大面积广泛性纤维化形成（图3），比较量化后的心肌纤维化损伤面积与心肌横截面面积比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与ISO 组相比，PNS 组能显著减少心肌纤维化损伤，具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 各组小鼠心肌HE染色（×50），局部放大图片（×200）

2.4 PNS 组对ApoE-/-小鼠心肌胶原纤维沉积的抑制作用

与ApoE-/-组相比，ISO 组小鼠心肌组织间隙大量胶原纤维浸润（图4），比较量化后的CVF 值，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与ISO 组相比，PNS 组能减少心肌纤维化面积，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 各组小鼠心肌组织天狼星红染色（×200）

2.5 PNS组对斑块中Ly6G、MPO表达的抑制作用

ApoE-/-组和ISO 组小鼠斑块中可见大量Ly6G、MPO 表达（图5），比较斑块内Ly6G、MPO 的平均荧光强度，ApoE-/-组与ISO 组相比，Ly6G、MPO 表达无显著差异（P＞0.05）。与ApoE-/-组和ISO 组相比，PNS 组Ly6G、MPO表达显著降低（P＜0.05）。

图5 各组小鼠主动脉根部斑块Ly6G、MPO免疫组织化学法染色（×400）

2.6 PNS 组减少心肌纤维化部位Cit-H3 和Ly6G 的产生

与ApoE-/-组相比，ISO 组小鼠心肌损伤部位中可见大量Cit-H3、Ly6G 表达（图6），经比较斑块内Cit-H3、Ly6G 的平均荧光强度，ISO 组小鼠斑块内Cit-H3、Ly6G 表达显著升高（P＜0.05）。与ISO 组相比，PNS 组Cit-H3、Ly6G表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

图6 各组小鼠心肌损伤部位Cit-H3、Ly6G免疫组织化学法染色（×400）

3 讨论

NETs 从2004 年被发现以来，其在心血管领域的研究已经得到迅速发展。NETs 促进免疫反应的发展及持续，在AS 形成中发挥重要调控作用[7]。大量实验和临床文献将NETs 与许多CVD 联系起来，NETs 可以加速CVD 发展，其分泌到胞外的DNA、组蛋白以及蛋白酶等NETs组分可作为自身抗原引起炎症[8-9]。NETs在急性心肌梗死、不稳定斑块和血栓形成中具有重要的作用，这提示NETs具有作为治疗靶点的潜力。

PNS 作为三七的主要有效成分，对多种心血管疾病均有良好的防治作用，且安全无明显毒副作用。近年来，有关三七及PNS 治疗心血管系统疾病的报道较多，在一系列有关PNS 治疗CVD 的药理学作用研究中，其对于NETs的作用探索还是一个盲点。

ISO 皮下注射建立的心肌缺血模型是一种相对无创、简单的经典模型[10]，本研究中在高脂饮食8 周后叠加注射5 天ISO 模拟临床上的AS 伴急性心肌损伤的病理进程，结果提示，ISO 在对心肌造成损伤的方面效果显著，在本模型中ISO 没有显著加剧AS中斑块的面积，但是在脂质沉积方面的作用显著，提示本研究中ISO 对于斑块的影响还处于AS 早期阶段，ISO 对小鼠的刺激仅增加了内膜损伤部位的脂质沉积，还未进展到斑块形成阶段。相比于近期一篇研究采用6周的高脂饮食叠加ISO注射模拟与本研究相似临床模型中显示，ISO 刺激6 周会增加高脂饮食ApoE-/-小鼠的斑块面积[11]。本文拟探索的侧重点是动脉粥样硬化伴急性心肌损伤情况下PNS 多靶点效应和可能的机制，因此采用短期注射ISO 造模，诱导急性心肌损伤模型符合临床，以期为其临床应用提供实验依据，并且本研究中斑块部位病理染色结果也提示了该复合模型建立的可行性以及对于临床中病症发展过程较高的模拟性。此外，基于前期研究基础[5]，PNS 采用腹腔注射方式给药，保证了其在小鼠体内的生物利用度。

综上，本文在动物实验层面，通过高脂饮食的ApoE-/-小鼠叠加注射ISO 的模型，从抑制相关免疫机制触发这一方面，系统评价了PNS对AS伴急性心肌损伤的治疗作用，对PNS 干预NETs 的药理学机制进行了分析与探索。

本研究结果显示，PNS 可以减轻ISO 小鼠斑块面积和斑块内脂质沉积，改善ISO小鼠心肌损伤，减轻心肌组织排列紊乱和心肌组织胶原纤维沉积。Ly6G 作为中性粒细胞标志物，可以评价病变部位中性粒细胞粘附情况。MPO 是缺血损伤过程中的关键炎症酶和治疗靶点，在病理过程中通过促进活性氧的产生介导氧化应激，调节中性粒细胞极化等炎症相关信号通路[12]。同时MPO、Cit-H3 作为NETs 的主要组分，是用于评价中性粒细胞NETs 释放的高度特异性标志物，免疫组织化学法染色结果提示，PNS 可以减轻斑块内Ly6G、MPO 和心肌部位Ly6G、Cit-H3 的表达。本文结果提示PNS抑制中性粒细胞产生NETs进而减缓AS和急性心肌损伤的进一步加重。

以上，PNS的双重治疗效果为理解AS及其并发症的病理机制提供了新的思路，有望进一步挖掘PNS 其在更多领域和层面发挥理想的多重治疗效果。