三种浙产铁皮石斛多糖的结构及免疫功效探究

李镜锐,陶文扬,杨 颖,周万怡,陆胜民,*,王阳光,*

(1.浙江海洋大学 食品与药学学院,浙江 舟山 316022; 2.浙江省农业科学院 食品科学研究所,浙江 杭州 310021)

铁皮石斛是我国传统的名贵中草药,享有中国“九大仙草之首”的美誉[1],传统医学记载其具有延缓衰老、滋阴美容等生理功能。铁皮石斛含有多糖、多酚、类黄酮、生物碱等多种生物活性成分[2-4],其中多糖占比高达20%～40%(m/m干重),是铁皮石斛中含量最高、最受关注的生理活性成分[5],具有调节免疫力、抗肿瘤、抗炎及保护胃肠道等多种生理功效[5-9],其免疫调节因作用显著且药效温和,从而备受关注。

雁荡山地区雨量充沛,气候温暖湿润,得天独厚的生态环境特别适合铁皮石斛生长,是铁皮石斛的传统道地产区,浙江省的首家铁皮石斛药食同源试点加工企业即落户雁荡山地区,加工需求量很大,由此也带动了当地的种植业的发展,发展前景十分广阔[10]。但目前本地的石斛品种混杂栽培,既有当地野生驯化种,也有其他地区的驯化种。前期研究发现,石斛多糖的结构和生物活性会因其品种和产地不同而异[11-12]。浙江雁荡山地区不同附生树种铁皮石斛多糖含量存在显著差异[13],但对于主栽品种并无梳理,不同品种之间多糖结构和生理活性的差异从未有过报道,给其精准应用带来很大困扰。

为了比较研究雁荡山基地不同种铁皮石斛多糖(Dendrobiumofficinalepolysaccharide,DOP)的结构和免疫功能,本文选择雁荡山地区的3个主栽品种,对其多糖进行提取纯化,通过HPLC、硫酸苯酚法、HPGPC、FT-IR等方法对其多糖样品进行初步的结构表征,并通过RAW 264.7巨噬细胞模型初步评估3种多糖的细胞免疫调节活性,为功能评价及精准应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雁斛1号石斛茎、雁斛3号石斛茎、圣兰8号石斛茎采自浙江省温州市雁荡山;透析袋、脂多糖(LPS)购自上海源叶生物科技有限公司;DMEM高糖培养基、PBS购自北京索莱宝科技有限公司;FBS(胎牛血清)购自浙江天杭生物科技技术有限公司;青霉素-链霉素溶液购自广州赛国生物科技有限公司;CCK-8溶液、NO试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;中性红购自上海麦克林生化科技有限公司;小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞株购自武汉博士德生物工程有限公司。

SHJ-2AB多孔恒温磁力搅拌水浴锅购自常州金坛良友仪器有限公司;SCIENTZ-1ON冷冻干燥机购自宁波新芝生物科技股份有限公司;VERTEX70红外光谱仪购自德国布鲁克分析仪器公司;Herocell 180 CO2培养箱购自海润度生物科技有限公司;FTMX4R倒置显微镜购自深圳市方特科技有限公司;ELX800型酶标仪购自美国BIOTEK公司。

1.2 方法

1.2.1 DOP的提取纯化

目前多糖主要的提取分离手段是通过水提醇沉法获得水溶性多糖[14]。取铁皮石斛鲜茎500 g,加入7.5 L水匀浆,于70 ℃恒温水浴锅中振荡提取40 min后经粗纱布过滤,4 000 r·min-1离心10 min收集上清液后加入30 L乙醇,4 ℃静置醇沉12 h后经2 000目滤布过滤得到沉淀。将沉淀复溶于蒸馏水,用8 000～14 000 u透析袋透析72 h,期间每4 h换水。透析结束后将样品真空冷冻干燥72 h。

1.2.2 DOP单糖组成测定

分别取1 mL 1 mg·mL-1的岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、半乳糖醛酸(GalA)和葡萄糖醛酸(GlcA)标准品置入安瓿瓶,获得混合标准溶液。

称取5 mg DOP样品置于安瓿瓶,加入1 mL 2 mol·L-1盐酸甲醇溶液,于80 ℃下水解10 h后,氮吹至干。再加入1 mL 2 mol·L-1三氟乙酸(TFA)完全酸水解,于121 ℃水解2 h后,氮吹除去TFA。

向装有DOP样品的安瓿瓶中加入1 mL 3 mol·L-1NaOH和1 mL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-甲醇溶液,混合均匀。从瓶中吸取200 μL混合液,于70 ℃水浴0.5 h。水浴结束后,加入200 μL 0.3 mol·L-1HCl溶液混匀,再加入1.4 mL CH3Cl充分振荡反应。反应液去除多余的PMP-甲醇试剂和CH3Cl溶液后,用0.45 μm滤膜过滤,用于高效液相色谱仪检测。

1.2.3 DOP总糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖样品中的总糖含量[15]。称取Glc和Man 0.050 g,定容至250 mL,得到浓度为0.2 mg·mL-1的标准品溶液。分别量取标准品溶液0、2、4、6、8、10 mL,定容至10 mL。

分别量取1 mL 0.5 mg·mL-1待测样品或标准溶液,加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸,振荡摇匀。沸水浴10 min后在冰水中冷却10 min,在波长490 nm处测量吸光度。石斛多糖多为葡甘聚糖,结合其葡甘比,可通过以下方程计算DOP样品中Glc和Man含量。

iCG+nCM=iCG′=nCM′。

其中CG表示每g DOP样品中含有的Glc量;CM表示每g DOP样品中含有的Man量;CG和CM的比值为DOP样品中Glc和Man的摩尔比;CG′表示每g DOP样品通过Glc标准曲线测得的百分含量;CM′表示每g DOP样品通过Man标准曲线测得的百分含量;i表示每g DOP样品中Glc可反应的吸光度值;n表示每g DOP样品中Man可反应的吸光度值。

1.2.4 DOP分子量测定

分别取10 mg重均分子量(Mw)为180、2 700、9 750、36 800、135 350的葡聚糖标准品溶解于2 mL去离子水,经0.45 μm滤膜过滤后用于高效凝胶渗透色谱测定分子量,进样量为5 μL。高效凝胶渗透色谱检测条件:采用Waters1525 HPGPC;色谱柱使用UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm内径,2根色谱柱串联);检测器为2414示差折光检测器;柱温为45 ℃。流动相为0.1 mol·L-1NaNO3;流速为0.9 mL·min-1。根据标准品保留时间及分子量绘制葡聚糖分子量标准曲线,得到拟合方程。

称取一定量DOP样品溶解于0.1 mol·L-1NaNO3中,配置成浓度为5 mg·mL-1的样品溶液,经0.45 μm滤膜后上机检测,进样量为5 μL。根据标准曲线计算得到样品中的分子量。

1.2.5 DOP的红外光谱分析

分别取1.0 mg DOP样品与150.0 mg KBr混合,研磨并压片,压片应透明无颗粒。在4 000～400 cm-1区间内扫描FT-IR吸收。

1.2.6 RAW 264.7巨噬细胞模型实验

RAW 264.7细胞的预培养。小鼠巨噬细胞株RAW 264.7细胞于DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗溶液)中,在含有5% CO2,37 ℃恒温培养箱中培养。待细胞处于对数生长期时(细胞贴壁面积占培养瓶底部的80%～90%)传代。细胞传代三代后用于后续实验。

DOP处理后的细胞增殖率测定。于96孔板中每孔接种100 μL浓度为3×105mL-1的RAW 264.7细胞,待细胞贴壁后去除上清液,加入含有不同浓度DOP(0、5、10、20、40、80、160、320、640、1 280 μg·mL-1)的新鲜培养基,培养24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,继续培养1 h,450 nm处测定吸光度。细胞增殖率为实验组在450 nm的吸光度与对照组在450 nm的吸光度的比值。

DOP处理后细胞NO产生量测定。于96孔板中每孔接种100 μL浓度为3×105mL-1的RAW 264.7细胞,待细胞贴壁后去除上清液,加入含有不同浓度DOP(0、5、10、20、40、80、160、320、640、1 280 μg·mL-1)的新鲜培养基,同时设置1 μg·mL-1的LPS阳性对照组,每组设置8个平行。处理24 h后,每孔吸取50 μL上层培养液于新的96孔板,参照NO试剂盒说明书测定NO生成量。

1.2.7 数据统计分析

实验数据采用SPSS 20.0软件分析,使用单向方差分析(ANOVA)分析数据,试验结果用平均数±标准差表示,当P<0.05时具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 单糖组成

单糖是决定多糖结构和特性的基本单位[16]。多糖经酸水解后可利用HPLC研究其单糖组成。结果如图1所示。通过与相同条件下标准品的保留时间比较来确定峰的归属。结果表明,DOP1、DOP2和DOP3均由Ara、Gal、Glc和Man这4种单糖组成,但3种石斛多糖的单糖比例不同。选定Gal的物质的量为1,计算得到Ara、Glc和Man的摩尔比。DOP1中Ara、Gal、Glc、Man的比例为0.73∶1∶179∶274;DOP2中为0.56∶1∶332∶292;DOP3中为0.44∶1∶121∶190。3种多糖均为杂多糖,且均为葡甘聚糖,其中Glc和Man质量分数均占多糖的99.9%左右,本结果与之前的报道一致[17]。

1,Ara;2,Gal;3,Glc;4,Man.图1 三种石斛茎多糖DOP1、DOP2和DOP3的单糖组成Fig.1 The monosaccharide composition of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1, DOP2 and DOP3

2.2 总糖含量

采用苯酚-硫酸法测定多糖样品中的总糖含量,根据2.1节结果可知,DOP样品中Glc和Man质量分数均占多糖的99.9%左右,故Ara和Gal的比例可以忽略不计。根据DOP样品中Glc和Man的摩尔比,计算DOP样品中甘露糖和葡萄糖的含量,结果如表1所示。测得3种DOP的纯度较高,尤其是DOP2的总糖含量达到94.78%。

表1 DOP总糖含量Table 1 Total sugar content in DOP

2.3 分子量

分子量可以反映多糖的分子链长度,是多糖生物活性的主要影响因素之一,多糖的生物活性通常随着分子量的变化而变化[16]。DOP1、DOP2和DOP3的高效凝胶渗透色谱图分析结果如图2所示,根据葡聚糖标准品绘制标准曲线方程,利用分析软件求得多糖分子量。

图2 三种石斛茎多糖DOP1、DOP2和DOP3高效凝胶渗透色谱图Fig.2 High performance gel permeation chromatogram of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1, DOP2 and DOP3

在HPGPC色谱图中,3种多糖均含3个峰。DOP1的3个峰在色谱中的保留时间分别为13.52 min、17.40 min和19.20 min;DOP2的保留时间分别为13.60 min、17.25 min和19.19 min;DOP3的保留时间分别为13.93 min、17.55 min和19.23 min。DOP1由3个峰组成,峰分子量(Mp)分别为1.85×106u、1.27×104u和1.28×103u;DOP2的Mp分别为1.95×106u、1.95×104u和1.40×103u;DOP3的Mp分别为1.70×106u、1.30×104u和1.33×103u。3种多糖均包含一个低分子量组分,可能由于黏度过大,各个糖链相互纠缠,经过长时间的透析仍然无法将其去除。现有的研究报道,不同来源、不同提取分离纯化方法得到的铁皮石斛分子量差异很大[14],本实验获得的多糖分子量符合现有报道范围。3种多糖的分子量差异较小,DOP2分子量略高于另外两种多糖。

2.4 红外光谱

图3 三种石斛茎多糖DOP1 (a)、DOP2 (b)和DOP3 (c)的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1 (a), DOP2 (b) and DOP3 (c)

2.5 RAW 264.7巨噬细胞模型实验

2.5.1 DOP处理后的细胞增殖率测定

作为机体免疫的第一道防线,巨噬细胞是多糖的关键靶细胞,可以作为抗原呈递细胞,与T淋巴细胞相互作用,调节适应性免疫反应[23]。多糖的免疫调节作用始于巨噬细胞或淋巴细胞的活化[24]。这个过程不仅可以促进各种细胞因子的释放,还可以刺激免疫细胞的增殖[25]。DOP对RAW 264.7细胞增殖的作用结果如图4所示,RAW 264.7细胞24 h后细胞活力均大于90%,表明铁皮石斛多糖对细胞无毒副作用。此外,DOP1和DOP2在640、1 280 μg·mL-1浓度条件下能促进小鼠巨噬细胞RAW 264.7的增殖;DOP3在320、640、1 280 μg·mL-1浓度条件下都对细胞有增殖作用,且浓度为640、1 280 μg·mL-1时增值效果显著(P<0.000 1)。结果表明,3种DOP都参与了RAW 264.7细胞的活化,而DOP3在较低浓度时即对RAW 264.7细胞发挥增殖作用,其增殖效果在3种DOP中最好。

****,P<0.000 1。图4 三种石斛茎多糖DOP1 (a)、DOP2 (b)和DOP3 (c)对RAW 264.7细胞增殖作用的影响Fig.4 Effects of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1 (a), DOP2 (b) and DOP3 (c) on proliferations rate in RAW 264.7 cell

2.5.2 DOP处理后的细胞NO产生量测定

NO是活性氮的中间产物,是具有氧化性质的自由基[26],能有效地起到免疫调节剂的作用[27]。免疫刺激性多糖与细胞受体相互作用,在细胞中触发不同的信号响应,反过来又促进下游效应分子(NO)的分泌,增强宿主的免疫功能[28]。结果如图5所示,DOP1对于RAW 264.7细胞的免疫应答无影响,1 600 μg·mL-1DOP2能够促进NO释放,800 μg·mL-1DOP3能够促进NO释放,且在1 600 μg·mL-1浓度时产生显著差异(P<0.05)。3种DOP的免疫调节功能差别较大,DOP3最强,DOP2效果不显著,而DOP1没有效果。该结果与上述2.5.1节巨噬细胞增殖实验的结果相符。

*,P<0.05。图5 三种石斛茎多糖DOP1 (a)、DOP2 (b)和DOP3 (c)对RAW 264.7细胞NO释放的影响Fig.5 Effect of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1 (a), DOP2 (b) and DOP3 (c) on NO release from RAW 264.7 cells

综上所述,DOP1、DOP2和DOP3可以促进巨噬细胞的增殖以及巨噬细胞NO的释放,并且DOP3在高浓度下效果显著,表明DOP3的免疫调节活性优于其他两种DOP。导致3种DOP免疫调节活性不同的原因可能是其结构性质的差异,包括分子量和单糖组成比例。即不同种铁皮石斛多糖在结构性质上的明显不同,导致其生理活性产生显著差异,这与他人的研究结果一致[7]。此外,已有研究报道50 μg·mL-1的铁皮石斛水溶性多糖(DOPW)就具有显著的免疫效果[1],而本实验的3种多糖需要在较高浓度条件下展现出细胞免疫调节活性,其可能原因DOP的品种、提取过程、纯度以及作用机理等差异会影响铁皮石斛多糖的细胞免疫功效。另一方面,可能不同来源、结构的多糖,其免疫调节的作用途径不同[11],我们将进一步深入研究其他免疫调节途径,系统阐述浙产石斛多糖的功效及构效机理。

3 结论

本文提取了雁荡山基地的3个不同品种铁皮石斛的茎多糖,初步比较了3种石斛多糖的结构差异,并初步评价了其免疫调节活性。结果表明,DOP2的3个组分峰分子量均高于另外两种多糖,且甘露糖含量少于葡萄糖含量,其余两种多糖甘露糖占比更高。红外光谱表明这3种多糖均是以β构型为主的吡喃杂多糖。在3个不同种铁皮石斛的免疫活性比较中,3种多糖在高剂量下对RAW 264.7细胞都具有一定的增殖作用,其中圣兰8号铁皮石斛茎多糖的增殖效果最好。且圣兰8号铁皮石斛茎多糖样品对RAW 264.7细胞NO释放也有显著作用。3种石斛多糖在分子量、单糖组成和单糖连接方式上差异不大,但其免疫活性不同。其作用机制还有待进一步探索。本研究结果可为铁皮石斛生理活性研究提供参考,为石斛多糖的精准开发与利用奠定基础。