归肾丸对卵巢储备功能减退小鼠模型卵巢自噬的影响

河北医科大学公共卫生学院

朱文渊 杜彦芳△(石家庄 050017)

提要 目的：探讨归肾丸对卵巢储备功能减退(DOR)小鼠卵巢功能和自噬的影响。方法：将C57BL/6小鼠随机分为5组：正常组、模型组、归肾丸低、中、高剂量组。除正常组外，各组小鼠采用腹腔注射环磷酰胺(CTX)法建立DOR小鼠模型并给予相应药物。ELISA法检测血清抗苗勒管激素(AMH)、促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)水平；HE染色观察卵巢组织形态；Western blot、qRT-PCR检测卵巢组织微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin 1、p62蛋白和mRNA水平。结果：与正常组相比，模型组小鼠血清FSH、LH水平升高(P<0.05)，AMH、E2水平降低(P<0.05)；卵巢中生长卵泡和原始卵泡的数量减少，闭锁卵泡增加；卵巢组织LC3和Beclin 1蛋白和mRNA水平增高，p62蛋白和mRNA水平降低。经归肾丸干预后，DOR小鼠血清中FSH和LH激素水平降低(P<0.05)，AMH和E2激素水平增高(P<0.05)；卵巢形态改善，原始卵泡和生长卵泡增多，闭锁卵泡减少；卵巢组织中LC3和Beclin 1的蛋白及mRNA水平降低，p62蛋白及mRNA水平升高。结论：归肾丸可以明显改善DOR小鼠的卵巢功能，可能通过抑制卵巢组织自噬发挥作用。

卵巢储备功能减退(DOR)是发生在女性40岁之前，卵巢内可募集的卵泡数量和卵母细胞质量均有下降，卵巢功能随之减退的一种疾病，是导致患者生育能力下降的主要原因[1]，严重影响患者的生殖健康和生活质量，若不及时、尽早的干预，可在短时间内进展为卵巢早衰。有证据表明，线粒体自噬参与卵泡闭锁，将导致卵巢衰老[2-3]，可见自噬在DOR的发生发展中具有重要的作用。

《妇人规》记载：“经候不调，病皆在肾经。”肾为先天之本，与天癸、冲任密切相关，肾主持调控月经。中医认为DOR的主要病机是肾虚，在治疗上常提倡补肾为主。《景岳全书》中记载归肾丸有补肾健脾、益气养血之功效，且临床应用治疗DOR疗效较好[4]。本研究以归肾丸为代表方，研究归肾丸对DOR小鼠卵巢组织自噬的影响，探讨归肾丸通过抑制自噬改善卵巢功能的可能作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级雌性C57BL/6小鼠50只，小鼠均为6～8周龄，体质量18～25 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要药物 归肾丸主要组成：熟地黄、山茱萸、山药(炒)、菟丝子、枸杞子、杜仲(盐炒)、当归、茯苓。购自国药乐仁堂石家庄医药有限公司。将药物分别溶解至0.07 g/mL、0.14 g/mL、0.28 g/mL低中高浓度，4℃冷藏保存，备用。注射用环磷酰胺：购自MCE公司，HY-17420。

1.3 主要试剂 抗体LC3(Proteintech公司，货号：14600-1-AP)，抗体Beclin 1(Proteintech公司，货号：11306-1-AP)，抗体p62(Affinity公司，货号：AF5384)，抗体GAPDH(Proteintech公司，货号：60004-1-Ig)，HRP兔二抗(Proteintech公司，货号：SA00001-2)，HRP鼠二抗(Proteintech公司，货号：SA00001-1)，小鼠血清FSH(Elisa Biotech公司，EIA-2424)、AMH(Elabscience公司，E-EL-M3015)、E2(Elabscience公司，E-OSEL-M0002)、LH(Elisa Biotech公司，EIA-2348)检测试剂盒。

2 实验方法

2.1 动物模型建立 所有小鼠适应性喂养1 w后，行阴道脱落细胞学检查，记录动情周期。选择具有规律动情周期的40只小鼠纳入实验，将小鼠随机分为5组：正常组、模型组、归肾丸低剂量组、归肾丸中剂量组、归肾丸高剂量组，每组8只。正常组给予等体积生理盐水腹腔注射。模型组、归肾丸低、中、高剂量组一次性腹腔内注射环磷酰胺(CTX)75 mg/kg进行造模，并连续监测动情周期7 d，出现动情周期紊乱为造模成功。造模成功后，归肾丸低、中、高剂量组分别给予相应剂量归肾丸0.2 mL/10 g体质量灌胃，1次/d，连续灌胃28 d，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。

2.2 ELISA法检测小鼠血清中抗苗勒管激素(AMH)、促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)的含量 小鼠麻醉后取血，之后在室温环境下静置1 h，4℃ 3 000 r/min离心20 min，提取上层血清，分别按照小鼠血清AMH、FSH、E2、LH检测试剂盒说明书进行检测。

2.3 HE染色观察各组小鼠卵巢形态 将经4%多聚甲醛固定的小鼠卵巢组织进行石蜡包埋，5 μm切片。石蜡切片经脱蜡、复水、抗原修复、苏木素染液染色、伊红染色等步骤，70%乙醇漂洗，中性树胶封片后，在正置显微镜下观察其形态并拍照。

2.4 qRT-PCR检测小鼠卵巢组织中微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin 1、p62 mRNA表达水平 卵巢组织匀浆，按照试剂盒说明书提取卵巢组织总RNA。按照逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA后，按SYBR qPCR Master Mix使用说明书进行PCR。以GAPDH表达量作为内参对照，采用2-ΔΔCt法计算各目的基因相对表达量。引物见表1。

表1 PCR引物序列

2.5 Western blot法检测小鼠卵巢组织中LC3、Beclin 1、p62的蛋白水平 裂解卵巢组织提取总蛋白，蛋白定量后进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用半干式转膜仪转膜后，将膜置于5%TTBS配置的脱脂奶粉液中室温封闭2 h。采用TTBS洗膜液洗膜，10 min×3次，然后分别用抗LC3(1∶1 000)、Beclin 1(1∶1 000)、p62(1∶1 000)抗体4℃孵育过夜。次日洗膜后，二抗1∶10 000室温孵育2 h，TTBS洗膜液洗膜，10 min×3次，再用TBS洗膜1次，5 min。最后用超灵敏多功能成像仪(LAS 4000，美国GE公司)检测抗原抗体特异性结合条带，拍照。

2.6 统计学方法 采用IBM SPSS 28.0软件对数据进行统计分析。计量资料用¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠卵巢组织形态变化 正常组卵巢组织可见原始卵泡和生长卵泡，颗粒细胞排列有序，未见明显的闭锁卵泡；与正常组相比，模型组小鼠原始卵泡和生长卵泡较少，闭锁卵泡较多，颗粒细胞层次较少，间隙较大；与模型组相比，归肾丸低、中、高剂量组小鼠生长卵泡及成熟卵泡增多，闭锁卵泡数目减少，卵巢实质结构有所改善。见图1。

注：A.正常组；B.模型组；C.归肾丸低剂量组；D.归肾丸中剂量组；E.归肾丸高剂量组(下同)。图1 归肾丸对DOR小鼠卵巢组织形态的影响(HE，×200)

3.2 各组小鼠血清AMH、FSH、E2、LH水平 在模型组中，小鼠血清的FSH、LH水平较正常组明显升高，AMH、E2水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，归肾丸中、高剂量组血清FSH、LH水平降低，AMH、E2水平增高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 归肾丸对DOR小鼠血清中AMH、FSH、E2、LH水平的影响

3.3 各组小鼠卵巢组织中LC3、Beclin 1、p62蛋白水平比较 与正常组相比，模型组小鼠卵巢组织中LC3、Beclin 1蛋白水平明显升高(P<0.05)，p62蛋白水平明显降低(P<0.05)；与模型组相比，归肾丸中、高剂量组LC3、Beclin 1蛋白水平明显降低(P<0.05)，p62蛋白水平明显升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性，提示归肾丸可以抑制DOR小鼠卵巢组织自噬。见图2、表3。

表3 各组小鼠卵巢LC3、Beclin 1、p62蛋白水平比较

3.4 各组小鼠卵巢组织中LC3、Beclin 1、p62 mRNA水平比较 与正常组相比，模型组卵巢组织中LC3、Beclin 1 mRNA水平明显升高(P<0.05)，p62 mRNA水平明显降低(P<0.05)；与模型组相比，归肾丸中、高剂量组LC3、Beclin 1 mRNA水平明显降低(P<0.05)，p62 mRNA水平明显升高(P<0.05)。详见表4。

表4 各组小鼠卵巢LC3、Beclin 1、p62 mRNA水平比较

4 讨论

中医理论中，多依据患者的临床表现，将DOR归为“月经后期”“血枯”“闭经”“经水早断”等范畴，若疾病发展严重影响生育能力和妊娠结局，还可以将其归属于“不孕症”或“滑胎”的范畴[5]。《素问·上古天真论》曰：“女子七岁肾气盛……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”对肾-天癸-冲任-胞宫这一生殖轴的生理特点作出了描述。《傅青主女科》亦云：“经水出诸肾。”肾水足则月经多，肾水少则月经少，说明了肾气的充盈与否直接影响着经血的充盈。肾藏精，为先天之本，生殖之根，若肾中精气盛，则天癸至如常，月经充盈而有子；而若肾虚阴阳失调，心、肝、脾之气失和，则易生气滞、血瘀、痰凝等，造成冲任胞宫失养瘀阻，DOR则随之发生[6]。因此，“肾气虚弱，天癸不充，冲任不盛”是卵巢功能障碍的病理机制[7]。故临床以补肾法为治疗DOR的经验之法，结合患者体质、兼夹证候及月经周期辨证论治，从而平衡脏腑气血阴阳。

归肾丸出自《景岳全书》，张景岳谓其为“左归、右归二丸之次者也”。具有补肾填精、平衡肾中阴阳的功效，用于治疗肾水真阴不足、精衰血少之证，常见腰痠脚耎、形容憔悴、遗泄阳衰等证候[8]。归肾丸由熟地黄、杜仲、山药、山茱萸、菟丝子、枸杞子、当归、茯苓8味药物组成，治疗DOR临床疗效较好[9]。方中重用熟地黄滋肾阴、益精髓，填补真阴为君药；配伍枸杞子甘平益精明目，山茱萸酸温滋肾益肝为臣药；更有山药滋益脾胃，当归补血养肝，菟丝子、杜仲补肝肾、强筋骨、明目益精，茯苓健脾渗湿为佐使药。诸药相合，共奏滋补肝肾、益精补血之功。临床研究表明，归肾丸可以明显降低肾虚型DOR不孕症患者LH、FSH水平，提高窦卵泡数、最大卵泡直径、卵巢血流参数，改善临床症状及卵巢功能，提高妊娠率[4，10]。归肾丸加减能够显著改善肾虚型DOR不孕患者的临床症状，改善其卵巢功能、临床妊娠率，并可提高血清TGF-β1、GDF-9和BMP-10水平[11]。动物研究证实，归肾丸可以通过调控DOR小鼠Oct-4、MVH和Egr-1的基因表达，调节动情周期，提高始基卵泡的数目[12]。加减归肾丸可通过影响卵巢组织PI3K/AKT/mTOR信号通路改善卵巢功能[13]。

自噬是一种自我降解过程，通过消除多余或受损的亚细胞蛋白质和细胞器来保持细胞和生物体的稳态，自噬降解产物的过度积累导致自噬细胞死亡。颗粒细胞围绕在卵泡周围，在卵泡生长、发育和成熟的各个阶段都发挥着重要作用。在卵泡发育的各个阶段均发生着颗粒细胞自噬，与卵巢疾病的发生和发展息息相关[14]。研究发现，颗粒细胞的自噬参与了卵泡的闭锁[3，15]。研究表明，环磷酰胺的活性代谢物磷酰胺氮芥干预颗粒细胞后，提高了活性氧自由基在细胞内的表达水平，上调了自噬标志性蛋白Beclin 1的表达，自噬被过度激活，导致卵泡丢失增加[16]。血清激素FSH可通过PI3K-AKT信号通路抑制转录因子FoxO1的转录活性，进而抑制氧化损伤诱导的颗粒细胞自噬[17]。朱芳芳等[18]研究发现，环磷酰胺腹腔注射诱导的DOR小鼠模型中，LC3B显著升高，p62降低，DOR小鼠卵巢颗粒细胞自噬过度激活，而麒麟丸可通过抑制DOR小鼠卵巢内的过度自噬，抑制始基卵泡的过度激活，闭锁卵泡数量减少，卵巢储备功能从而得到改善。同时，麒麟丸也可调控卵巢组织HIF-1α/Bnip3/Beclin1信号通路保护卵巢功能，治疗DOR[19]。黄欣怡等[20]发现左归丸含药血清的干预可显著下调颗粒细胞中自噬凋亡相关蛋白的表达水平，颗粒细胞的凋亡减少，进而改善卵巢储备功能。王昭等[21]研究发现补肾养精汤则在mRNA水平降低了Beclin 1和Lc3Ⅱ的表达，促进p62的表达，颗粒细胞的自噬得到抑制，各级卵泡的发育得到促进，卵巢储备功能从而得到改善。研究发现，左归丸可以降低化疗源性卵巢早衰小鼠颗粒细胞自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达，降低颗粒细胞凋亡率，保护卵巢功能[22-24]。本研究显示CTX造模后小鼠卵巢LC3、Beclin 1表达升高，p62表达降低，卵巢出现过度自噬，损伤卵巢功能；归肾丸干预后，卵巢组织中LC3、Beclin 1表达降低，p62表达升高，逆转了过度自噬状态，改善了激素水平。

自噬过多或不及，都有可能造成肌体阴阳失衡，这体现了中医理论中的阴阳互根互用、以及阴阳消长平衡，是阴阳平衡的微观基础[25]。当细胞自噬过多，代谢产物分解过多，则阳亢；当细胞自噬不及，代谢产物堆积过多，则阴盛[26]。因此，笔者认为，归肾丸可能通过调控肾阴肾阳的平衡来调节细胞自噬水平，促进自噬的动态平衡，对于防治DOR具有重要的意义。

综上所述，归肾丸可能通过抑制CTX诱导卵巢组织自噬，恢复卵巢功能，以达到治疗DOR的目的，为归肾丸的临床应用提供科学依据。然而涉及的具体机制及相关信号通路，尚待进一步研究。