H5N2 亚型禽流感病毒分离鉴定与鸡致病性研究

范航，路卫星，邵国宾

（辽宁农业职业技术学院，辽宁营口 115009）

禽流感病毒的亚型较多，这是其最为明显的生物学特征，因为病毒类型变异频繁，导致种类较多，目前已知的禽流感病毒就有多个NA 亚型和HA 亚型，而且从全世界的家禽、野生禽中，也已经发现了多种不属于亚型的禽流感病毒，此疾病在临床上主要表现为感染、呼吸道疾病、蛋产量急剧下降等，并且在家禽、野生禽的群体中表现出了极高的致死性[1]。虽然H5N2 亚型禽流感病毒，是一种高致病性禽流感病毒，这种病毒对禽类的危害，比美国先前在其他4 个州发现的禽流感病毒更加严重，随着禽流感病毒抗原的重组和突变，再加上动物与人类之间不可避免的接触，这样一来禽流感的暴发，不仅对养殖业带来经济损伤，更威胁到了人类的生命安全[2]。因此，调查H5N2 亚型禽流感病毒的分离鉴定与鸡致病性，能进一步推测此病毒在鸡群中传播危害，以此为有效防制H5N2 亚型禽流感病毒奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 病毒株与动物选取

1.1.1 病毒株

4 株 分 离 株：DK/GX/240D16/18（H5N2）、DK/GX/228D15/18 （H5N2）、DK/GX/221D22/18（H5N2）、GS/GX/240G32/18（H5N2），由实验室分离并进行保存。

1.1.2 动物选取

本研究中SPF 鸡胚购物北京某公司，按照规定要求饲养在隔离器中，直到研究观察结束[3]。

1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA 试剂盒；pMD-18T 载体；RNA 酶抑制剂；M-MLV 反转录酶；SL-PAA 受体；TMB 底物显色液；过氧化物酶；PNA 凝胶；dNTP；M-MLV 逆转录酶[4]。

1.3 病毒的增殖及鸡胚半数感染量（EID50）测定

1.3.1 病毒增值

样品采集和处理：在活禽市场中采集不同几种家禽的咽拭子和肛拭子，采用内含抗生素的PBS 溶液，抗生素种类分别为青霉素、庆大霉素、硫酸链霉素等，将咽拭子和肛拭子充分浸泡其中，并进行反复的浸泡和挤压，给予离心速率5000 转/分钟，离心时间为5 分钟，得到上层清液，保存备用。鸡胚接种：将收集到的上层清液，接种于SPF 鸡胚中，并另外选取未接种的鸡胚作为对照，在接种后将SPF 鸡胚放置于专业保温箱中进行孵化，并在24 小时内收集未死鸡胚和已死鸡胚的尿囊液，观察并记录好鸡胚的生长情况。血凝试验：对收集到的尿囊液进行血凝试验，将血凝效价高于4 log2 的尿囊液鉴定为阳性样品，并进行保存；而将低于此标准的尿囊液，继续接种然后再保存；接种三次后仍然无血凝效价，则视为阴性样本。

1.3.2 鸡胚半数感染量（EID50）测定

对4 株H5N2 亚型禽流感病毒分离出来的尿囊液，使用含抗生素的PBS 溶液进行稀释，并且每株分离株需要按照血凝效价进行接种胚胎，选取5 个稀释度中，每个各接种5 枚，放置于保温箱中孵化，每日定时观察并记录鸡胚的死亡情况，并收集每个死亡鸡胚的尿囊液进行血凝效价试验，记录每个稀释度的感染情况，最后按照公式（lgEID50=稀释系数对数×距离比例+高于病毒稀释对数）来测定鸡胚半数感染量[5]。

1.4 全基因组分析

根据病毒DNA/RNA 抽提与反转录法，抽取出了4 株分离株的RNA 模板，并将其进行反转录、PCR 扩增。扩增程序：NA、HA、PB 等基因选取PCR 扩增，扩增程序为高温预变性、变性、退火、延伸、第二轮扩增循环、结束反应。扩增程序：NS 基因采用常规扩增，扩增程序为高温预变性、变性、退火、循环、结束。

1.5 对SPF 鸡致病性试验

在H5N2 亚型禽流感病毒分离株感染后，采集感染组和未感染组的SPF 鸡胚，感染后第三天，随机选取5 只鸡给予安乐死后解剖，无菌环境下取各个器官来检测病毒的复制情况。

2 结果

2.1 序列进化分析

NA 基因：分析NA 亚型的基因进化序列可知，DK/GX/228D15/18（H5N2）和DK/GX/240D16/18 （H5N2）处在同一个基因序列，同源性高达97.5%。HA 基因：通过对比4 株病毒的HA 基因序列，发现在分离株之间氨基酸同源性和核苷酸同源性为97.0%、96.2%。PB 基因：通过对比4 株病毒的PB 基因序列，发现在分离株之间氨基酸同源性为85.2%，核苷酸同源性为86.5%。NS 基因：通过对比4 株病毒的NS 基因序列，发现分离株之间氨基酸同源性和核苷酸同源性分别为99.8%和99.9%。

2.2 病毒对SPF 鸡的感染性试验

5 只鸡的心肌组织小灶区域淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润，心外膜区域见小灶状淋巴细胞浸润；气管黏膜层灶状淋巴细胞浸润，气管黏膜上皮细胞脱落；肝脏肝细胞间隙变大，肝血窦轻度扩张充血，肝小叶内见多个点状坏死、灶状坏死，部分汇管区有淋巴细胞浸润。

3 讨论

近些年来，有较多研究发现，在禽流感病毒的传播过程中多是以猪作为中间媒介，这样就加大了禽流感与人流感充足的危险性，且再加上H5N2 亚型禽流感病毒的传染能力较强，给养殖户带来了一定的养殖风险，更影响到了社会人群的公共卫生安全。

本研究中，从禽类市场收集了400 余份家禽的咽拭子和肛拭子，其中共分离出了4 份H5N2亚型禽流感病毒，而在这4 株分离株对应的家禽上，3 只未表现为明显的临床症状，仅有1 只症状明显，说明H5N2 亚型禽流感病毒虽然具有高传染性，但隐性感染的表现力更强，需要养殖户进行警惕[6]。同时，病毒会对SPF 鸡的心肌组织、肝脏组织、气管组织等均造成感染影响。因此，加强我国禽类中禽流感病毒的监测，并了解H5N2亚型禽流感病毒的感染情况和流行情况，能够为有效防控H5N2 亚型禽流感病毒提供依据。