去亚甲基小檗碱对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡的影响

朱天立　孙琳　王炳超　马泽刚

［摘要］目的探討去亚甲基小檗碱（DMB）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡通路的影响。方法培养SH-SY5Y细胞，将其分为对照组、MPP+组、小檗碱（BBR，DMB的前体）＋MPP+组、司莱吉兰（selegiline，与DMB同为单胺氧化酶B抑制剂）＋MPP+组、DMB＋MPP+组。应用免疫印迹法检测各组bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白的表达。结果与对照组相比，MPP+组bcl-2/bax比值明显降低（F=42.58，q=17.89，P<0.001），DMB、BBR、selegiline处理均可以抑制MPP+诱导的bcl-2/bax比值降低（q=6.71～10.63，P<0.001），且selegiline处理效果强于BBR和DMB（q=3.93、3.59，P<0.05）。与对照组相比，MPP+组cleaved caspase-3蛋白表达明显上调（F=111.60，q=29.44，P<0.001），DMB、BBR、selegiline处理可以降低MPP+诱导的cleaved caspase-3蛋白表达上调（q=10.74～13.53，P<0.001），且3种药物处理效果差异无显著性。结论对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞，DMB可以升高bcl-2/bax比值，降低cleaved caspase-3蛋白的表达。

［关键词］小檗碱；SH-SY5Y细胞；线粒体；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；细胞凋亡

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0375-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.095［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230804.1522.005;2023-08-0417：38：52

EFFECTS OF DEMETHYLENEBERBERINE ON MITOCHONDRIAL CASPASE-DEPENDENT APOPTOSIS IN SH-SY5Y CELLS INDUCED BY MPP+ZHU Tianli， SUN Lin， WANG Bingchao， MA Zegang （Department of Physiology， School of Basic Me-dicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of demethyleneberberine （DMB） on the mitochondrial caspase-dependent apoptosis pathway in SH-SY5Y cells treated with 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+）. MethodsSH-SY5Y cells were cultured and divided into control group， MPP+ group， berberine （BBR， the precursor of DMB）+MPP+ group， selegiline （a monoamine oxidase B inhibitor similar to DMB）+MPP+ group， and DMB+MPP+ group. The ratio of bcl-2/bax and the expression of cleaved caspase-3 protein were determined by Western blot for each group. ResultsCompared with that in the control group， the bcl-2/bax ratio in the MPP+ group was significantly lower （F=42.58，q=17.89，P<0.001）. DMB， BBR， and selegiline all significantly inhibited the MPP+-induced decrease in the bcl-2/bax ratio （q=6.71-10.63，P<0.001）， and the effect with selegiline was significantly greater than that with BBR （q=3.93，P<0.05） and that with DMB （q=3.59，P<0.05）. Compared with the control group， the MPP+ group showed significantly higher expression of cleaved caspase-3 protein （F=111.60， q=29.44，P<0.001）. DMB， BBR， and selegiline significantly reduced MPP+-induced upregulation of cleaved caspase-3 protein （q=10.74-13.53，P<0.001）， with no significant difference in the treatment effects of the three drugs （P>0.05）.  ConclusionFor SH-SY5Y cells induced by MPP+， DMB can increase the ratio of bcl-2/bax and decrease the expression of cleaved caspase-3 protein.

［KEY WORDS］berberine; SH-SY5Y cells; mitochondria; caspase 3; apoptosis

帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，常见于老年人，其主要特征为黑质致密部多巴胺能神经元的选择性丧失[1-2]。导致PD的原因有很多，例如神经炎症、氧化应激、单胺氧化酶B（MAO-B）活性异常等。临床治疗PD的方式多为药物治疗[3]。去亚甲基小檗碱（DMB）是小檗碱（BBR）的主要代谢产物之一，被认为是BBR生物发生途径的中心中间体[4]。有研究表明，DMB具有抗氧化、抗炎、抗纤维化以及可逆抑制MAO-B活性的特性，提示DMB可能在神经退行性疾病中具有治疗潜力[5-7]。众所周知，线粒体相关的bcl-2/bax/caspase-3凋亡途径是一条非常典型的caspase依赖性凋亡途径。有研究结果表明，bcl-2、bax蛋白表达水平的变化，会激活caspase-3，启动caspase-3级联反应[8-11]。本研究用1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）处理SH-SY5Y细胞建立体外PD模型，观察DMB以及已经被证明具有保护作用的DMB前体BBR、同样为MAO-B抑制剂的司来吉兰（selegiline）对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白表达水平的影响。

1材料和方法

1.1实验材料

SH-SY5Y细胞购于中国科学院上海细胞库；DMEM高糖培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素溶液购自以色列Biological Industries公司；MPP+、BBR、selegiline和DMB购自美国GLP-BIO公司；兔抗bcl-2、兔抗bax、兔抗cleaved caspase-3和兔抗GAPDH抗体购自美国Cell Signaling公司；HRP标记山羊抗兔IgG 购自中国Abclonal公司；ECL发光液购于中国雅酶公司。

1.2细胞培养及分组

SH-SY5Y细胞置于温度为37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中，用DMEM高糖培养液培养，该培养液中含有体积分数0.10的胎牛血清和体积分数0.01的青霉素/链霉素。细胞培养2～3 d后进行传代，将状态良好的细胞接种于6孔板中，进行下一步实验。将细胞分为对照组（A组）、MPP+组（B组）、BBR＋MPP+组（C组）、selegiline＋MPP+组（D组）、DMB＋MPP+组（E组）。A组不做任何處理；B组使用1 mmol/L的MPP+处理SH-SY5Y细胞24 h；C组使用0.1 μmol/L的BBR和1 mmol/L的MPP+共同处理SH-SY5Y细胞24 h；D组使用100 μmol/L的selegiline和1 mmol/L的MPP+共处理SH-SY5Y细胞24 h；E组使用1 nmol/L的DMB和1 mmol/L的MPP+共处理SH-SY5Y细胞24 h。

1.3免疫印迹法检测bcl-2、bax、cleaved caspase-3蛋白的表达

各组SH-SY5Y细胞经过药物处理24 h后，用PBS洗涤3次，每孔加入100 μL RIPA裂解缓冲液在冰上裂解30 min。用刮板将细胞刮下，经离心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）提取细胞蛋白。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。将含有20 μg蛋白质的样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，随后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜置于50 g/L的脱脂牛奶中，室温封闭2 h，然后分别加入bcl-2（1∶1 000）、bax（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗4 ℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次10 min，加山羊抗兔IgG（1∶10 000）二抗室温孵育1 h。用ECL发光液显影，然后使用Image J软件分析bcl-2、bax和cleaved caspase-3蛋白表达。

1.4统计学分析

应用Graphpad Prism 7.0软件进行统计学分析。实验数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），然后采用Turkey法进行组间两两比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1DMB对MPP+处理的SH-SY5Y细胞bcl-2/bax比值的影响

各组细胞bcl-2/bax比值比较差异具有统计学意义（F=42.58，P<0.001）。与对照组相比，MPP+组细胞的bcl-2/bax比值显著降低（q=17.89，P<0.001）；与MPP+组相比，DMB＋MPP+组、BBR＋MPP+组和selegiline＋MPP+组的bcl-2/bax比值明显升高，差异有统计学意义（q=6.71～10.63，P<0.001）；与BBR＋MPP+组和DMB＋MPP+组相比较，selegiline＋MPP+组bcl-2/bax比值更高（q=3.59、3.93，P<0.05）；DMB＋MPP+组与BBR＋MPP+组相比，bcl-2/bax比值差异无统计学意义。见图1、表1。

2.2DMB对MPP+处理的SH-SY5Y细胞cleaved caspase-3蛋白的影响

各组细胞cleaved caspase-3蛋白水平比较差异具有统计学意义（F=111.60，P<0.001）。与对照组相比，MPP+组的cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上调（q=29.44，P<0.001）；与MPP+组相比，DMB＋MPP+组、BBR＋MPP+组、selegiline＋MPP+组的cleaved caspase-3蛋白表达降低，差异具有统计学意义（q=10.74～13.53，P<0.001）；3种药物处理组之间相比，cleaved caspase-3蛋白表达水平差异无显著性。见图1、表1。

3討论

PD是一种常见于老年人的神经退行性疾病[12]，其主要病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元的选择性丧失、路易小体（主要成分为α-突触核蛋白）形成[13]。PD的临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍，同时病人可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状[14]。临床治疗方式主要为药物治疗，包括多巴胺类似物、多巴胺受体激动剂、神经保护剂等。手术治疗是药物治疗的一种有效补充；康复治疗、心理治疗及良好的护理也能在一定程度上改善症状[15-16]。有效的治疗能显著提高PD病人的生活质量，PD病人的预期寿命与普通人群并无显著差异[17]。

DMB存在于天然药用植物芸香科植物黄柏中，亦可由盐酸小檗碱经过肝脏的首过效应代谢生成。DMB是BBR的主要代谢产物之一，是BBR生物合成的关键中间体，并且DMB在通过血-脑脊液屏障和发挥治疗作用方面比BBR更加有效。DMB具有抗氧化、抗炎、抗纤维化的特性。许多研究表明，DMB能抑制丝裂原活化蛋白激酶信号[18]，参与抑制核因子κB，因此认为DMB可以作为一种神经保护药物用于治疗PD[19]。而且，由于DMB可促进AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）信号传导，推测它可能通过调节AMPK的信号传导而有助于PD的神经保护[20]。有大量证据表明，多巴胺是MAO-B的底物，MAO-B抑制剂可以通过增加多巴胺含量治疗PD[21]。而有研究表明，DMB可以可逆地抑制MAO-B活性[22]。良好的生物活性使得DMB成为一个有吸引力的合成靶点，DMB可能在神经退行性疾病中具有治疗潜力[23]。

已知MPP+是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）的有毒代谢产物[24]，其结构接近多巴胺，会通过中脑多巴胺转运蛋白被选择性地转运进入神经元，选择性地毒害多巴胺能神经元，从而导致PD的症状[25]。本研究应用MPP+制备体外PD模型，探究DMB对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡通路的影响。本实验结果显示，经MPP+处理的SH-SY5Y细胞bcl-2/bax比值降低，cleaved caspase-3蛋白表达明显增加。这表明细胞在受到损伤后bcl-2/bax比值会降低，并且伴随着cleaved caspase-3蛋白含量的增加。有研究表明，BBR对MPTP诱导的PD模型小鼠多巴胺能神经元损伤具有保护作用[26]。另有研究表明，selegiline作为一种MAO-B抑制剂，对神经元的损伤具有保护作用[27-28]。为了检测DMB是否具有细胞保护作用，本研究使用DMB的前体BBR以及同为MAO-B抑制剂的selegiline与DMB进行对照，而这两种药物均已被证实具有细胞保护作用。有研究表明，bcl-2具有抗凋亡作用[29]。bax接收到凋亡信号刺激被激活后会破坏线粒体膜的完整性，释放cyt-c，进一步将caspase-3剪切为具有凋亡活性的cleaved caspase-3[30]。本实验结果显示，DMB处理能够有效抑制MPP+诱导引起的bcl-2/bax比值的降低，而且，MPP+诱导引起的cleaved caspase-3表达的升高在经DMB处理之后也会被抑制。BBR、selegiline、DMB虽然都有明显的抑制MPP+诱导引起的bcl-2/bax比值降低的作用，但selegiline的效果要略强于BBR和DMB，而DMB与BBR之间并无明显差别。BBR、selegiline、DMB均具有明显的抑制MPP+诱导引起的cleaved caspase-3表达升高的作用，且3种药物作用效果无明显差异。推测这种现象产生的原因可能为：DMB与BBR同为小檗属植物的天然产物，在特性上具有一定的相同之处，而selegiline并非天然植物产物，在作用方式上可能会与小檗属植物天然产物有所不同，从而在作用效果上产生差异。但其具体机制仍需进一步研究。

综上所述，本实验初步证明，DMB能够通过升高bcl-2/bax比值、降低cleaved caspase-3蛋白表达，抑制线粒体caspase依赖性的凋亡途径，从而对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞起到保护作用。本研究为DMB作为神经保护药物治疗PD提供了新的方案，但DMB起保护作用的深层机制还有待继续研究。

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（本文編辑马伟平）