高黏粘液型肺炎克雷伯菌临床分布、毒力基因检测及耐药分析

乔艳,孙红,应冲涛,陶赵宇,郭普

(1.蚌埠医学院第一附属医院感染性疾病科,安徽 蚌埠 233004;2.蚌埠医学院第一附属医院检验科,安徽 蚌埠 233004;3.蚌埠医学院第一附属医院输血科,安徽 蚌埠 233004)

肺炎克雷伯菌是临床常见的条件致病菌,当机体免疫力低下时,可引起临床感染。1986年台湾首次报道导致患者肝脓肿的肺炎克雷伯菌,可引发转移性多部位脓肿,菌落特征表现为高黏粘液型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscous Klebsiella Pneumonia,hmKP)。hmKP可引起血流感染、脓肿、肺部感染和脑膜感染等,致病性强,致死率高,引起临床广泛关注[1]。近年来,hmKP在许多地区流行,且出现对多种抗菌药物耐药的菌株[2]。为了解hmKP的流行、毒力基因分布及耐药情况,本研究对蚌埠医学院第一附属医院2021年临床分离的hmKP进行荚膜血清分型、毒力基因和耐药率进行检测分析,现做如下报道。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集蚌埠医学院第一附属医院2021年1月至12月临床分离的肺炎克雷伯菌554株,剔除重复菌株。

1.2菌株鉴定和药敏实验 利用法国生物梅里埃股份有限公司生产的VITEK 2 Compact细菌鉴定药敏分析仪及配套试剂进行细菌鉴定和药敏实验。药敏结果的判读依据CLSI 2021版标准[3]。

1.3hmKP筛选 采用粘液丝实验:用接种环轻触血琼脂平板过夜培养的菌落,向外拉丝,>5 mm即为阳性,高毒力株,<5 mm为阴性[3]。

1.4PCR方法检测hmKP荚膜血清型和毒力基因

1.4.1基因引物 引物设计参照参考文献[4-5],K1、K2、K5、K54、K57、rmpA、aerobactin、iutA及magA基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,引物序列及产物大小,见表1。

表1 基因引物

1.4.2PCR扩增 使用煮沸法提取DNA模板,PCR反应体系:模板DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、2×PCR Mixture 25 μL、H2O 22 μL,合计50 μL。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,成像及结果分析,同时设阴性对照和阳性对照。

1.5碳青霉烯耐药hmKP全基因组测序 挑取经过18～24 h 37 ℃培养的血琼脂平板上的纯菌落加入3 mL的LB肉汤培养基中,经37 ℃、220 r/min摇床12 h培养后,取菌液1 mL,12 000 r/min离心2 min后,弃上清,留沉淀,用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取菌株DNA,超微量分光光度计检测回收产物的纯度和浓度,合格样品OD260/OD280为1.7～1.9。illumina Hiseq 2500测序平台(上海生工生物股份有限公司)对菌株进行全基因组测序。在Linnux系统下运行SPAdes-2.0软件拼接原始数据。

1.6统计学方法 采用WHONET 5.6软件进行药敏结果统计分析,利用SPSS 22.0进行数据统计分析,分类变量采用χ2检验进行分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1hmKP株分布 蚌埠医学院第一附属医院2021年1月至12月临床分离的554株肺炎克雷伯菌中hmKP 96株,占17.33%。分离自脓液29株,血液标本26株,痰液21株,胆汁6株,穿刺液5株,尿液5株,腹水4株。

2.2粘液丝实验 554株肺炎克雷伯菌中96株粘液丝实验阳性,见图1。

图1 粘液丝实验阳性菌株

2.396株hmKP对抗菌药物的耐药率 96株hmKP氨苄西林-舒巴坦耐药率为35.42%,头孢曲松、氨曲南、头孢替坦和哌拉西林-他唑巴坦等β-内酰胺类以及氟喹诺酮类抗菌药物环丙沙星和左旋氧氟沙星耐药率均低于15.00%。碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南、厄他培南耐药率分别为7.29%和8.33%。hmKP对于在测试的抗菌药物耐药率均低于普通肺炎克雷伯菌(P<0.05),见表2。

表2 96株hmKP对抗菌药物的耐药率

2.496株hmKP荚膜血清分型及毒力基因 96株hmKP荚膜血清分型:58株为K1型,占60.42%;K2型为16株,占16.67%。96株hmKP中92株携带毒力基因iutA基因,占95.83%;91株携带rmpA,占94.79%;86株携带aerobactin基因,占89.58%;58株携带magA基因占60.42%。8株碳青霉烯耐药的hmKP进行全基因组测序,荚膜血清型为K64型,均携带iutA、rmpA和aerobactin基因。见表3,部分菌株PCR扩增图,见图2。

注:M.Marker,1～3.菌株分离来自脓液标本,4～5.菌株分离来自痰液标本。

表3 96株hmKP荚膜血清分型及毒力基因的分布

3 讨论

hmKP常具有高毒力和高侵袭性特点,可引起严重的临床感染。近年来,国内外许多地区相继报道hmKP的感染,引起临床广泛关注[6-7]。

本组资料显示,从本院2021年中的554株肺炎克雷伯菌中检出96株hmKP,占17.33%。高于谢朝云等[6]对贵州某医院的检测结果12.17%,低于汤翠霞等[8]对广东省某医院的hmKP检出率36.5%。可见各地域流行情况有很大的差异性,及时了解本院的hmKP的流行情况,对于临床诊疗有重要的意义。本院分离的96株hmKP主要分离来自脓液、血液及呼吸道标本,与有关报道相近[1,6]。hmKP易感染形成肝脓肿,播散引起眼内炎等多部位感染。血液标本中分离的hmKP易随血流播散至全身各部位导致严重的侵袭性感染,因此,血液标本中分离出肺炎克雷伯菌应引起临床高度关注,实验室可以通过粘液丝实验对高黏粘液型菌株进行快速初筛,及时与临床医生沟通,以控制迁徙性感染的发生。

hmKP产生的肥厚荚膜可以使菌体逃避宿主的免疫杀伤。荚膜抗原是肺炎克雷伯菌重要的抗原成分,也是主要的毒力因子[9]。目前,根据抗原性不同,hmKP可以分为82个血清型,其中与人各种侵袭性感染密切相关的主要有K1、K2、K5、K20、K54和K57等血清型。本院检出的96株hmKP主要为K1和K2型,分别占60.42%和16.67%,与相关报道相近[10]。K1与K2型菌株毒力最强,是临床引起肝脓肿主要的病原菌,常引起严重侵袭性感染,同时携带rmpA、magA、aerobactin等多种毒力基因[11]。rmpA基因是参与肺炎克雷伯菌荚膜多糖合成的调控基因,携带rmpA基因菌株常为高黏性菌落,能够逃避宿主免疫攻击。rmpA需要与Terw、iucA和SilS等因子共同发挥调控作用。magA基因是一种粘液形成相关基因,主要位于K1型肺炎克雷伯菌中,与细菌的高黏性以及抗白细胞吞噬等有关[12-14]。本研究中96株hmKP中91株携带rmpA基因,携带率为94.79%,58株携带magA基因,携带率为60.42%。与相关报道相近[13-14]。aerobactin基因是一种合型铁载体蛋白,气杆菌素为铁载体活性主要成分,占90%,气杆菌素由iucABCD操纵子编码,其同源受体由iutA基因编码。携带aerobactin基因可以使肺炎克雷伯菌的毒力提高100倍,而且能在含抗菌药物的血清中发挥作用,编码aerobactin和rmpA的基因在同一质粒上,两种基因常同时表达,因此黏性菌株毒力强[15]。96株hmKP中86株携带aerobactin基因,携带率为89.58%,与相关报道相近[16]。58株hmKP同时携带rmpA基因、magA基因和aerobactin基因,说明本院hmKP毒力由多种毒力因子共同作用。

药敏结果显示,本院分离的96株hmKP对常用抗菌药物还保持较高的敏感性,头孢曲松、氨曲南、头孢替坦和哌拉西林-他唑巴坦等β-内酰胺类以及氟喹诺酮类抗菌药物环丙沙星和左旋氧氟沙星耐药率均低于15.00%,hmKP对在测试的抗菌药物的耐药率均低于普通型肺炎克雷伯菌,差异有统计学意义与有关报道一致[8,16]。但是,96株hmKP也对磺胺嘧啶甲噁唑、氨苄西林-舒巴坦和妥布霉素出现不同程度的耐药,耐药率达到15.00%及以上,值得关注的是hmKP菌株中出现了8株碳青霉烯类抗菌药物耐药的菌株,亚胺培南、厄他培南耐药率为7.29%和8.33%。碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌高黏粘液型株,对抗菌药物几乎全部耐药给临床治疗带来极为严峻的考验。8株碳青霉烯耐药的hmKP全基因组测序发现荚膜血清型均为K64型,携带多种毒力基因,与报道一致[17,18]。

综上所述,hmKP致病性强,易引起严重侵袭性感染,临床应引起高度关注,微生物检验者要加强对hvKP毒力基因及耐药性的检测,及时与临床沟通,以控制hmKP的感染与流行。