miRNA-184 与肾脏纤维化的相关性研究

陈彬，孙承斌，周建波，励黎，韩利娜

肾脏纤维化是各种原因引起的慢性肾脏病（CKD）进展至终末期肾病（ESRD）的共同病理特征，包括肾小球硬化、肾小管间质纤维化和血管硬化。流行病学调查发现全球成人CKD 的患病率在10%以上，约1%的患者不可避免地发展为ESRD[1]。无论是各种原发性肾小球疾病，还是糖尿病、高血压、输尿管阻塞等继发性肾脏病，肾功能的损害都与纤维化病变程度密切相关[2]。大量研究发现微小RNA（miRNA）与肾脏纤维化的发生发展密切相关。Krupa 等[3]发现在糖尿病患者肾组织活检样本中miRNA-192 表达下降。Kato等[4]发现，miRNA-192 通过抑制ZEBl/2而加速胶原合成，加剧基质沉积和肾小球硬化。本研究通过临床观察和动物实验探讨miRNA-184 与和肾脏纤维化之间的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年1 月至2018 年10 月在宁波市镇海区人民医院行肾脏病理检查的患者，将肾脏纤维化比例超过50%作为观察组32 例，其中男15 例，女17 例；年龄（34.4±11.5）岁。将没有肾脏损害，肾小球滤过率（CCR）＞90 ml-1· min ·1.73m-2，无肾脏影像学异常，无尿检异常（没有蛋白尿和或镜下血尿）的患者作为对照组30 例，其中男14 例，女16 例；年龄（34.0±12.6 ）岁。两组性别比、年龄差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。本研究经宁波市镇海区人民医院伦理委员会审批通过。

1.2 检测miRNA-184 表达水平 抽取观察组和对照组血清各3 ml，采用qRT-PCR 检测miRNA-184表达水平。（1）Trizol 法提取血清中RNA，取血清样本40l，加入Trizol裂解、离心、萃取、沉淀、洗涤，加入DEPC 水溶解RNA，分光光度计测定溶解情况。（2）反转录引物的设计及合成，引物的序列：5’-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGACGAGCTA-3’。（3）通过逆转录（RT）将RNA 转化为cRNA。（4）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增cRNA，使用的扩增引物。PCR 扩增引物1：5’-CGGCTGGACGGAGAACTGAT-3’，引物2：5’-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。

1.3 方法 将8 周龄雄性SPF 级C57 小鼠18 只（购自北京维利华实验动物技术有限公司），分为3组，每组6 只。第1 组给予单侧输尿管结扎（UUO）造模，第2 组假手术，第3 组不予任何处理。（1）UUO造模：小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.004 ml/g 体质量）麻醉，取仰卧位固定小鼠，术前消毒，于无菌条件下，取腹部正中白线为手术切口。寻找左侧输尿管并钝性分离输尿管至肾门，于小鼠肾脏下极和肾门处分别用6/0 号丝线结扎左侧输尿管，并于两结扎处之间剪断输尿管。右侧输尿管不予任何处理，缝合腹膜，消毒，缝合腹直肌和皮肤，再次消毒。（2）假手术：消毒麻醉均同前，取腹部正中白线为手术切口。仅寻找左侧输尿管并钝性分离输尿管至肾门，不予结扎左侧输尿管，同时右侧输尿管也不予任何处理。

1.4 病理切片及染色 1 周后处死小鼠取出肾脏组织，用4%甲醛溶液中固定、修块、乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片（1 ～2m）、烤片、保存，用Masson 染色。

1.5 检测小鼠肾脏中miRNA-184 表达水平 处死小鼠后留取1 g 左右肾脏组织做qRT-PCR 检测，操作步骤同1.2。

1.6 统计方法 采用SPSS 18.0 统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t 检验，3 组比较采用方差分析；计数资料比较采用2检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miRNA-184表达比较 观察组和对照组患者血清miRNA184含量分别为（3.13±0.34），（0.92±0.17），观察组miRNA184含量高于对照组（t=40.81，P＜0.05）。

2.2 小鼠肾脏miRNA184 表达比较 3 组小鼠肾脏中的miRNA184 含量差异有统计学意义（P＜0.05），UUO 模型组肾脏中的miRNA184 含量高于假手术组和未处理组（均P ＜0.05），假手术组与未处理组差异无统计学意义（P ＞0.05），见表1。

表1 3 组小鼠肾脏miRNA184 表达结果比较

3 讨论

miRNA 是一类长22nt 的非编码RNA，通过靶向结合在目的基因的3’UTR 区域，转录后抑制其表达，进而调控下游一系列的基因表达，参与了机体内细胞发育、增殖、分化和凋亡等众多生物学进程[5]。有文献报道miRNA-184 通过调控系膜细胞自噬活性影响肾脏系膜细胞氧化损伤和衰老[6]。Liu等[7]通过miRNA芯片检测和聚类分析发现在老年大鼠肾脏皮质miRNA-184、miRNA-150 和miRNA-132 的表达明显高于青年大鼠，进一步实验发现miRNA-184和miRNA-150可能通过共同作用于靶基因Rab1 和Rab31mRNA 从而在转录后抑制系膜细胞的自噬活性而调控系膜细胞衰老，肾脏衰老时伴随着出现肾小球肥大、系膜基质增多，最后导致肾小球硬化和小管间质纤维化等。

本研究发现肾纤维化患者中miRNA184 含量高于对照组，推测miRNA-184 可能在肾脏纤维化过程中起到重要作用。为了进一步证实肾脏纤维化过程中miRNA 在肾脏组织中的表达情况，本研究制作了UUO小鼠模型模拟肾脏纤维化的过程，结果发现左侧肾脏（结扎输尿管这侧）纤维化的特征明显（纤维化的比例超过50%），右侧肾脏无明显病变，代表造模成功，并且发现UUO模型小鼠肾脏组织中的miRNA-184表达量明显高于假手术小鼠和未处理小鼠，推测miRNA-184 与小鼠肾脏的纤维化过程有密切联系。

Zanchi 等[8]通过抑制靶标LPP3，建立了miRNA-184 与糖尿病肾间质纤维化的联系，LPP3 在调节参与多器官纤维化的脂质磷酸盐的生物合成和细胞信号转导[9]中起着关键作用。本研究并未证实miRNA-184 和肾脏纤维化之间的因果关系，也未涉及miRNA-184 是通过何种机制导致肾脏的纤维化，这些问题均要在今后的实验研究中一步探索。