DNMT3A对骨关节炎软骨细胞SOX9基因DNA甲基化修饰的影响*

霍少川 杨俊兴 刘付懿斐 郭富明 程文昌 温刘莹 钟嘉漫 蒋子云*

骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种全关节的复杂退行性疾病，其特征是软骨退行性变、软骨下骨增厚、骨赘形成、滑膜炎症及关节囊、韧带和相关肌肉的结构改变[1]。临床表现为骨关节的反复疼痛、肿胀，甚至功能障碍，严重影响着患者的工作和生活[2]，并且显著升高心血管事件、下肢深静脉血栓、髋部骨折及全因死亡率[3]。OA是一种多因素疾病，具有多种相关风险因素，包括性别、年龄、创伤、肥胖、关节损伤、关节过度使用和遗传因素（如转录控制和表观遗传调控的改变[4]）。DNA甲基化属于表观遗传调控方式的一种，由DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）催化和维持，在OA病理生理中具有重要作用，通常与基因沉默相关[5]。性别决定区域Y（SRY）相关的高迁移率族框9（SRY-related high-mobility group box 9, SOX9）是软骨细胞产生软骨基质所必需的转录因子，直接靶向编码关键软骨特异性细胞外基质成分的基因，调节软骨细胞外基质基因的表达[6-7]。国外研究发现OA软骨细胞中SOX9受DNA甲基化的调节[8]，但关于DNMTs对SOX9基因DNA甲基化修饰的调控机制相关研究尚不完全清楚。因此，笔者在OA软骨细胞中研究SOX9 基因DNA 甲基化状态，深入探讨DNMT3A对SOX9基因DNA甲基化的调控机制，有利于加深OA表观遗传调控的认识，为OA药物的开发及体内的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

实验细胞：人正常软骨细胞和OA 软骨细胞由广州中医药大学骨伤科实验室提供，实验过程符合广州中医药大学深圳医院（福田）伦理委员会要求。

主要试剂：中强度RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、ECL 发光液（杭州弗德生物科技有限公司）；TRIzol Reagent[天根生化科技（北京）有限公司]；荧光定量PCR检测试剂盒（中国GeneCopies 公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo Scientific 公司）；DNMT3A 抗体、SOX9 抗体、Collagen Ⅱ抗体、二抗HRP标记山羊抗兔IgG（美国Abcam公司）；β-actin抗体（北京博奥龙免疫技术有限公司）；甲苯胺蓝染色液（武汉赛维尔生物技术有限公司）；基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；亚硫酸盐处理及纯化试剂盒（德国QIAGEN公司）。

主要仪器：PCR 基因扩增仪TC-96/G/H(b)C（杭州博日科技有限公司）；ABI 3730XL 基因测序仪（赛默飞世尔科技公司）；ND5000超微量紫外可见分光光度计（北京百泰克生物技术有限公司）；电泳仪（韩国Bioneer公司）；细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司）；生物倒置显微镜[尼康映像仪器销售（中国）有限公司]；纯水仪（上海和泰公司）；苏净安泰SW-CJ-1FD 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；脱色摇床（江苏其林贝尔仪器公司）；超速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

将细胞以3.5×105cells/mL 接种于25 cm2培养瓶，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。每3 d更换1次培养基，待软骨细胞贴壁达80%后，采用含青霉素和链霉素的PBS洗涤细胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，放置恒温箱1 min后反复吹打瓶壁上软骨细胞，收集细胞液，800 r/min，离心5 min，1∶2传代。培养过程中观察细胞生长、形态、细胞密度等生物学形态并拍照记录。

1.2.2 甲苯胺蓝染色

将第3代软骨细胞接种于6孔细胞培养板内细胞爬片上，待细胞培养24 h 后，用4%多聚甲醛在室温固定细胞1 h，PBS溶液洗涤细胞2次，1%甲苯胺蓝染色液孵育细胞2 h，蒸馏水漂洗后在倒置显微镜下进行观察并拍照记录。

1.2.3 免疫细胞化学染色

将第3代软骨细胞接种于6孔细胞培养板内细胞爬片上，待细胞贴壁培养24 h后，用4%多聚甲醛室温固定细胞10 min，PBS溶液洗细胞3次，用5%BSA于室温封闭30 min，加入一抗Collagen Ⅱ（1∶200 稀释）于4℃孵育细胞过夜，PBS溶液漂洗细胞3次，加入二抗HRP标记山羊抗兔IgG（1∶200稀释），37℃孵育细胞30 min，PBS溶液漂洗细胞3次后加入显色液进行显色，最后终止显色反应后，将细胞置于倒置显微镜下拍照记录。

1.2.4 慢病毒载体构建及病毒包装

1.2.4.1 慢病毒载体构建

根据DNMT3A 的mRNA 序列，在上海吉玛制药技术有限公司合成并构建了沉默DNMT3A的慢病毒载体和对照载体，分别命名为Sh-DNMT3A和Sh-NC。Sh-DNMT3A正义链序列：5'-CACCGCCAGATGTTCTTCGCTAATTTCAAGAGAATTAGCGAAGAACATCTGGTTTTTTG-3'，反义链序列：5'-GATCCAAAAAACCAGATGTTCTTCGCTAATTCTCTTGAAATTAGCGAAGAACATCTGGC-3'； Sh-NC 正义链序列：5'-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTG-3'， 反义链序列：5'-GATCCAAAAAAGTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAC-3'。

1.2.4.2 慢病毒包装

将构建的质粒及慢病毒包装辅助质粒（pCMV-dr8.91和pMD2.G）扩增后进行质粒抽提，并浓缩至浓度大于1 g/L备用。在细胞培养皿中培养293T 细胞至80% ～ 90%汇合度时，将构建的质粒与Lenti-XTM HT包装系统共转染，分别于转染后48 h 和72 h 收集培养上清，0.45 μm 滤膜过滤后，在超速离心机中离心2 h，最后用400 μL 新鲜的培养液将病毒液重悬，备用。

1.2.4.3 慢病毒感染软骨细胞

取第3代软骨细胞，按照2×105cells/孔的量将细胞接种于6 孔板中。在培养箱中培养过夜后，吸去孔内原有培养基，加入1 mL 1640 培养基，并加入polybrene 至终浓度为5 μg/mL，以MOI=100加入对应体积的病毒原液，于37℃、5%CO2条件下孵育4 h。之后向培养孔内补加1 mL 1 640培养基，于37℃、5%CO2条件下孵育过夜。

1.2.5 qRT-PCR检测

取第3 代软骨细胞，以1×105cells/mL 浓度接种6 孔板中，每孔加2 mL细胞悬液，培养48 h后按照Trizol试剂盒步骤提取样本总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA 浓度，并进行逆转录反应成cDNA。反应体系为：cDNA 2 μL，50× Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 3.6 μL，上下游引物各2 μL。反应条件为：95℃初始变性10 min，95℃变性10 s，40 个循环，55℃退火20 s，72℃延伸35 s。用2－△△Ct法计算基因表达的相对倍数。设计引物：DNMT3A上游引物：5'-GCCCATTCGATCTGGTGATT-3'，下游引物：5'-GGCGGTAGAACTCAAAGAAGAG-3'；SOX9 上 游引物：5'-TGACCTATCCAAGCGCATTAC-3'，下游引物：5'-GCTTGCTCTGAAGAGGGTTTA-3'；GAPDH 上游引物：5'-CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG-3'，下游引物：5'CTACATGGCAACTGTGAGGAG-3'。

1.2.6 Western Blot检测

取第3 代软骨细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度为1×105cells/mL，接种6 孔板中，每孔加2 mL 细胞悬液。培养48 h 后加入RIPA 裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上孵育30 min，4℃，13 000g，离心30 min，获取总蛋白。BCA 法测定蛋白的浓度，经SDS-PAGF电泳将蛋白转入PVDF膜上，然后将膜在5%脱脂牛奶中封闭1 h，之后加入一抗SOX9（1∶2 000稀释），4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，加入山羊抗体二抗-HRP（Jackson，111-035-003，1∶10 000稀释），室温条件下孵育30 min。使用ECL工作液在X射线片上显影、定影，以β-actin（1∶2 000稀释）为内参，采用Image J软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.2.7 亚硫酸氢盐测序

采用基因组DNA 提取试剂盒提取人正常软骨细胞和OA软骨细胞DNA，取基因组DNA 1 μg进行亚硫酸盐转化并纯化回收。引物的设计：SOX9上游引物：5'TTTTGGATTTTTTTATGAAGATGA-3'，下游引物：5'CCCACACCATAAAAACRTT-3'。PCR 反应体系：DNA 2 μL，2×PCR Mix 25 μL，ddH2O 21 μL，上下游引物各1 μL。反应条件为：95℃初始变性4 min，94℃变性30 s，52℃变性30 s，40个循环，72℃退火40 s，72℃延伸5 min。采用亚硫酸盐处理及纯化试剂盒将目标片段割胶纯化。采用Generay的pTG19-T（Lot：GV6021）载体克隆试剂盒进行克隆。采用XL10-Gold感受态，按照产品说明进行转化、复苏和涂板。酶切法鉴定阳性菌落挑取质粒进行测序。

1.3 统计学方法

数据处理应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞光镜下观察

正常软骨细胞和OA软骨细胞呈长梭形或多角形，胞核为圆形或椭圆形，核仁为单个或多个。正常软细胞成簇现象，突起相连结，周围有基质样物质沉积，呈“铺路石样”（见图1A）。OA软骨细胞数量、突起连结、“铺路石样”细胞群落及软骨细胞外基质分泌明显减少（见图1B）。

图1 两组软骨细胞形态（×200）：A. 正常软骨细胞；B. OA 软骨细胞

2.2 两组细胞甲苯胺蓝染色

软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性可见细胞核成蓝色，胞质及细胞间质成紫色。正常软骨细胞形态规则，体积较大，数量较多（见图2A）；OA 软骨细胞形态不规则，体积较小，数量较少（见图2B）。

图2 两组软骨细胞甲苯胺蓝染色（×200）：A. 正常软骨细胞；B. OA软骨细胞

2.3 两组细胞Ⅱ型胶原染色

Ⅱ型胶原染色阳性可见核仁成深蓝色，胞质区成浅蓝色，细胞外基质染成棕黄色，说明软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。正常软骨细胞形态规则，体积较大，数量较多（见图3A）；OA骨细胞形态不规则，体积较小，数量较少（见图3B）。

图3 两组软骨细胞Ⅱ型胶原染色（×200）：A. 正常软骨细胞；B. OA软骨细胞

2.4 两组细胞DNMT3A、SOX9表达水平比较

采用qRT-PCR方法检测SOX9在mRNA水平表达情况，如图4A所示。正常软骨细胞DNMT3A、SOX9 mRNA表达水平分别为1.00±0.08、1.00±0.05，OA软骨细胞DNMT3A、SOX9 mRNA 表达水平分别为5.41±0.63、0.57±0.05，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。采用Western Blot方法检测DNMT3A、SOX9蛋白水平的表达情况，如图4B、4C所示，正常软骨细胞DNMT3A、SOX9蛋白表达水平分别为0.65±0.01、0.29±0.03，OA 软骨细胞DNMT3A、SOX9 蛋白表达水平分别为1.05±0.04、0.18±0.03，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 两组细胞DNMT3A、SOX9 表达水平：A. qRT-PCR 检测两组细胞DNMT3A、SOX9 mRNA 表达水平；B. Western Blot 检测两组细胞DNMT3A、SOX9蛋白条带；C. DNMT3A、SOX9蛋白定量分析结果

2.5 两组细胞SOX9基因CpG岛甲基化差异

从正常软骨细胞和OA软骨细胞获取DNA进行亚硫酸氢盐处理，计算SOX9 启动子共32 个CpG 位点的百分比（CpG 甲基化百分比）。如图5 所示，正常软骨细胞SOX9基因DNA甲基化百分比为0.63%，OA软骨细胞SOX9基因DNA 甲基化百分比为17.81%，说明SOX9 基因DNA 甲基化修饰增加可能导致OA发生。

图5 SOX9启动子亚硫酸氢盐测序棒棒糖图：○为非甲基化CpG，●为甲基化CpG

2.6 沉默DNMT3A慢病毒株效果的验证

OA 软骨细胞在不感染病毒（Blank）、感染对照病毒（Sh-NC）或感染沉默DNMT3A 慢病毒（Sh-DNMT3A）72 h，采用qRT-PCR方法对所构建的病毒的效果进行检测，如图6A 所示，Sh-NC mRNA 表达水平为1.02±0.09，Sh-DNMT3A mRNA 表达水平为0.49±0.07，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；采用Western Blot方法对所构建的病毒的效果进行检测，如图6B、6C所示，Sh-NC蛋白表达水平为1.03±0.02，Sh-DNMT3A 蛋白表达水平为0.30±0.05，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图6 沉默DNMT3A慢病毒效果验证：A. qRT-PCR检测三组细胞DNMT3A mRNA表达水平；B. Western Blot检测三组细胞DNMT3A蛋白条带；C. DNMT3A蛋白定量分析结果

2.7 两组细胞SOX9基因DNA甲基化修饰差异

在OA 软骨细胞中感染沉默对照病毒（OA+Sh-NC）和感染沉默DNMT3A 病毒（OA+Sh-DNMT3A）72 h。获取OA 软骨细胞，进行亚硫酸氢盐处理，计算SOX9 启动子共32 个CpG 位点的百分比（CpG 甲基化百分比）。如图7 所示，OA+Sh-NC SOX9 基因DNA 甲基化百分比为12.50%，OA+Sh-DNMT3A SOX9 基因DNA 甲基化百分比降至4.38%。

3 讨论

表观遗传修饰是指在未发生DNA 序列改变的情况下，基因表达和功能发生的可遗传改变，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA[9]。DNA甲基化是指在DNMTs的作用下，将甲基添加到胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸（CpG）中的胞嘧啶的C5 位置以形成5-甲基胞嘧啶[10-11]。DNMTs 家族有4 个成员，DNM3A 为其中的一员，被称为从头甲基化酶[12-13]。商安全等[14]研究发现，DNMT3A在人OA软骨细胞中高表达，抑制DNMT3A的表达能够增强骨关节炎软骨细胞的生长与增殖。本研究采用qRT-PCR、Western Blot检测人OA软骨细胞中DNMT3A表达量增高，与上述结果一致。

SOX9 属于由20 个SRY 相关的HMG 盒蛋白组成的家族，在软骨生长板的肥大软骨细胞中受到抑制，但在整个生命过程中，仍在健康关节软骨的永久软骨细胞中表达[15]。SOX9 是调节软骨细胞表型和活性的关键转录因子，具有确保软骨细胞谱系的定型，促进细胞存活并转录激活许多软骨特异性结构成分和调节因子的作用[6]。与健康软骨细胞相比，人类OA 软骨细胞中SOX9 的表达降低[16]。OA 软骨细胞SOX9 启动子甲基化增加，SOX9 下调，降低了SOX9 的结合亲和力[17]。本研究发现，人OA 软骨细胞中SOX9 基因DNA 甲基化百分比增高，SOX9 表达量降低，与上述结果一致。

DNA甲基化通过干扰转录因子与其靶位点的结合直接抑制基因活性，或通过募集形成甲基-CpG结合蛋白复合物（部分甲基-CpG 结合域蛋白）间接促进基因沉默[18]。CpG位点的DNA甲基化百分比通常采用亚硫酸氢盐焦磷酸测序分析确定，如Imagawa 等[19]采用焦磷酸测序分析COL9A1启动子甲基化状态，发现CpG 甲基化减弱了SOX9 与COL9A1启动子的结合。本研究也采用亚硫酸氢盐焦磷酸测序检测SOX9基因DNA甲基化状态，发现人OA软骨细胞中SOX9基因DNA甲基化百分比增高，采用慢病毒在OA软骨细胞中沉默DNMT3A后SOX9基因DNA甲基化百分比降低，解释了OA病变中DNMT3A对SOX9的调控机制。

综上，在OA 软骨细胞中SOX9 启动子甲基化增高，DNMT3A mRNA 和蛋白表达量增高，沉默DNMT3A 能够降低SOX9 基因DNA 甲基化状态，初步探讨了OA 软骨细胞病变的表观遗传机制。