不同离心参数对小剂量全血白膜法采血袋制备富血小板血浆回收率的影响*

张 彬,陆 华,宋娜丽,王世春,刘 奇,吴春曦,易中梅△

(1.陆军军医大学第一附属医院输血科/中国人民解放军重庆血站,重庆 400038;2.重庆医科大学附属第二医院输血科 400010)

富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)在治疗难愈合性创面、关节损伤及皮肤年轻化等应用医学的效果优势,让PRP的制备技术也得到飞速发展[1-2]。目前PRP分为手工分离制备和血细胞分离机采集(机采),机采回收率稳定,但需患者有足够的血容量及良好的心肺功能,在采集过程中,能够耐受短时间内≥400 mL血液短暂离体。体重较轻的患者血容量较少、年纪较大的患者心功能对失血的耐受性差,采集风险较大。对于低体重又需用自体PRP的患者,小剂量全血白膜法血袋制备技术显得尤为重要。全血来源现有制备剂量200、300、400 mL,采血袋制备PRP均有相关制备技术的报道[3-5],为了弥补更小剂量全血采血袋制备PRP的研究空白,本课题组对50、100 mL全血不同制备参数下获得PRP回收率进行了比较分析,旨在确定该条件下制备PRP的最佳方法,更好地满足临床需求,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集相同来源的全血50、100 mL各75袋。仪器和试剂:一次性使用塑料四联采血袋(批号210818,四川南格尔公司),50、100 mL转移袋(批号210401、210402,四川南格尔公司),大容量低温离心机(型号6000i,德国Thermo公司),Hemax330血球计数仪(山东烟台),CM735A采血秤(韩国森通公司),SE250热合机(韩国森通公司),分光光度计(型号UNIC7200,上海尤尼柯公司)。本研究经陆军军医大学第一附属医院伦理委员会审批通过[伦理批件号:(A)KY2021057]。

1.2 方法

1.2.1分组

将相同来源的全血50、100 mL各75袋根据离心时间(9、11、13、15、17 min)分为5组,每组15例,手工分离白膜,比较白膜层血小板回收率。将白膜10 mL×60袋、20 mL×70袋根据离心时间(9、13、17 min)分为3组,分离PRP,在20 mL白膜70 g离心力时增加1组21 min离心时间,分组增加为4组,每组均为10例,比较PRP血小板回收率;同时检测并比较在该条件下PRP血小板低渗休克反应(hypotonic shock response,HSR)比率,每组各6例。

1.2.2确定离心力

第1次离心:根据团队前期制备浓缩血小板的经验参数(1 875 g,22 ℃,15 min)[6],离心时间及温度不变,均使用100 mL转移袋,倍比下降整数设置离心力梯度,依次为940、470、240 g。肉眼观察白膜层的紧实度适宜:全血取出时,白膜层无浑浊,分离时白膜层上浮无附壁。50、100 mL全血分别确定离心力为470、940 g。第2次离心:参照参数(70～100 g,22 ℃,10 min)[7-8],离心时间及温度不变,均使用50 mL转移袋,设置离心力梯度为100、70 g,肉眼观察红细胞下沉的紧实度适宜,10、20 mL白膜分别确定离心力为70、100 g。

1.2.3制备PRP

将50、100 mL全血进行第1次离心,分别按照470、940 g,(22±2)℃,9、11、13、15、17 min离心,分离白膜层为10、20 mL,分离后静置1 h,震摇30 min,测量白膜层血小板计数,计算白膜层血小板回收率。将白膜10、20 mL分别以70、100 g,(22±2)℃,9、13、17、21 min(仅在70 g比较)进行第2次轻离心,分离PRP,静置1 h,震摇30 min,检测血小板计数,计算PRP血小板回收率。

1.2.4测定HSR比率

PRP用自身贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP)稀释至血小板 200×109/L～400×109/L,与PPP、蒸馏水均置于37 ℃保温,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)pH 7.4,PPP与PBS按2∶1的体积比混合调零,PRP与PBS 按2∶1的体积比混合作为对照管,PRP与蒸馏水按2∶1的体积比混合作为样品管,在610 nm处读取样品最小吸光度(A)值及15 min时A值,并按下列公式计算HSR比率:

1.2.5观察指标

全血白膜层血小板回收率、白膜层PRP血小板回收率、PRP HSR比率。

1.2.6标本留取

白膜混匀后留取0.5 mL,测定血小板计数;PRP留取4～7 mL,进行血小板计数,再检测HSR比率。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同离心时间白膜层血小板回收率比较

50 mL全血在470 g离心11～17 min白膜层血小板回收率处于较高水平,差异有统计学意义(P<0.05);100 mL全血在940 g离心11～15 min白膜层血小板回收率处于较高水平,差异有统计学意义(P<0.05)。两种剂量白膜层血小板回收率可在离心11 min时即达到较高水平,见表1。

表1 不同离心时间白膜层血小板回收率比较

2.2 不同离心时间PRP血小板回收率比较

10 mL白膜在70 g、离心13 min PRP血小板回收率最高,差异有统计学意义(P<0.05);20 mL白膜在100 g、离心13 min PRP血小板回收率最高,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 不同离心时间PRP血小板回收率比较

2.3 不同离心时间PRP HSR比率比较

10 mL白膜在70 g、离心13 min及100 g、离心9 min PRP HSR比率最高,差异有统计学意义(P<0.05);20 mL白膜在70 g、离心17 min及100 g、离心13 min PRP HSR比率最高,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 不同离心时间PRP HSR比率比较

3 讨 论

血小板制剂用于临床非输注性(局部)治疗或输注性(全身)治疗,均是全血来源的血小板浓缩物,制备技术及临床需求既有重叠又存在较大区别(为了方便论述,文中PRP仅指非输注性血小板制剂),如两者血袋白膜法制备的技术原理完全相同,但50、100 mL全血提取的血小板终产品由于剂量小(10～20 mL),输注后不能达到治疗效果,既无临床需求,也未发现相关的制备参数报道,但作为PRP进行局部治疗有广阔的应用空间,相应的制备参数也需研究确定并完善发展。PRP含有大量的生长因子及纤维蛋白,对创面及损伤的修复有极大优势[7,9-10]。小剂量全血制备PRP适合低体重及创面小的患者,因容量小,手工分离制备技术更加精细;且相关研究较少,可借鉴的经验不足;较标准量全血(200、300、400 mL)制备PRP更加困难。文献报道小剂量全血多采用离心管制备,制备过程开放环节有污染的风险[8];或是套装制备,需要现场采集,立即制备,尽快使用,且不可储存,在使用时间上受到制约。小剂量全血采血袋制备PRP技术全程封闭,无菌接驳分装备用,既规避了开放环节风险的发生,又可储存,可灵活地调整使用时间。

50、100 mL全血第1次离心后收集白膜为10、20 mL(定量),血小板回收率(变量)最高的数据反映的是最佳离心条件。本研究显示,使用采血袋制备小剂量全血,50、100 mL全血470、940 g,(22±2)℃,离心11 min时,全血白膜层血小板回收率即达到较高水平。与文献报道400 mL全血四联采血袋制备的白膜层血小板回收率(87.0%)相比较[11],本研究白膜层血小板回收率略低,因本实验使用的全血剂量小,如果血袋的整个制备流程血小板耗损量相同,由于全血剂量小而耗损占比更高,白膜层血小板回收率则会较低。该报道还阐述了改变制备血袋的结构,可减少血小板损失,明显提高回收率,所以改变血袋结构可成为提升小剂量全血白膜层回收率的研究方向之一。本研究显示,10、20 mL白膜在70、100 g,(22±2)℃,离心13 min PRP血小板回收率最高。与本课题组前期研究的400 mL全血6联袋制备浓缩血小板回收率(68.7%)相比,离心温度无改变,但本研究得到的PRP血小板回收率较高[12],说明50、100 mL全血第2次(即对白膜层的离心)离心力及离心时间均是更加适宜的离心参数。

HSR是通过在体外低渗休克环境中,血小板膨胀后再恢复正常体积的能力来反映血小板体内存活率,是评价血小板功能的体外指标,HSR比率越高,血小板活性恢复越好[13]。本研究显示,100 mL全血制备的PRP第2次离心为70 g、离心17 min时,HSR比率为(59.53±6.60)%,继续延长离心时间到21 min也不会导致HSR比率下降,即体内存活无明显下降,与离心100 g相比,离心13 min HSR比率为(45.74±3.28)%,说明离心力越轻,HSR比率越高,血小板损伤越小。离心70 g、13 min时,HSR比率最低[(34.72±4.47)%)],离心力最轻,HSR比率却最低。分析认为,虽然HSR受PRP温度、存放时间等因素影响,但因各组的条件一致,不是差异产生的决定性条件[14-16]。此外,PRP中混杂的红细胞较多,在HSR实验中添加蒸馏水的环节造成细胞部分溶血,影响透光度导致离心时间更长时HSR比率更低,而非PRP中血小板功能受到影响[14]。同时表明,检测HSR比率时,红细胞应尽可能去除完全,否则影响实验结果。在100 g、离心13 min时,HSR比率为(59.39±4.10)%,与70 g、离心17～21 min相当,随着离心时间延长,HSR比率下降,说明离心时间越短,HSR比率越高,血小板损伤越小[17]。本着提升工作效率的原则,相同的HSR比率选取用时最短的参数,综合PRP回收率,100 mL全血制备PRP,第2次离心的优选参数为100 g、(22±2)℃、13 min。同理50 mL全血制备PRP,第2次离心优选参数为70 g、(22±2)℃、13 min。

综上所述,50、100 mL全血白膜法采血袋制备PRP能够获得理想的回收率,在其他离心条件相同的情况下,第1次离心力分别为470、940 g,离心11 min,第2次离心力分别为70、100 g,离心13 min,回收率最佳。该方法是标准剂量全血(200、300、400 mL)制备PRP的补充方法。