一种新型黏度和硫化氢荧光探针的制备及应用

杜宇婷，潘彩霞

(忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000)

硫化氢（H2S）是一种重要的生理气体分子[1].许多证据表明，H2S 与一些疾病相关如炎症和癌症等相关[2-3]，并且它被公认为可以调节广泛的生理过程比如血管扩张、血管生成、细胞凋亡和和神经调节等[4-8].在生物学上，H2S 与某些细胞器有关如线粒体[9-10]，线粒体内的H2S 已被证实在氧化应激和细胞死亡中具有保护作用[11-13].另外，细胞内的黏度是一个重要的微环境参数，在维持细胞内最基本的信号中发挥重要的作用[14].更加重要的是，H2S 水平的异常和黏度改变两者都与阿尔茨海默病(AD)和帕金森疾病有关[15-18].因此，开发一种有效的检测工具同时监测细胞内H2S 和黏度对阿尔茨海默病(AD)和帕金森疾病的探究和诊断具有重要意义.

在众多分析方法中，荧光探针技术被认为是最有发展前途的生物传感技术，因为它能够实现原位实时监测，具有极好的的生物相容性和实现高空间和时间分辨率等[19-24].荧光探针能够广泛用于检测细胞内和动物体内离子、代谢物和生物分子等[25-27].目前，大多数荧光探针已被广泛应用于检测特定的分析物，但是它们很难做到同时检测多种生物分子[28-32].近年来，虽然已经报道了一系列的荧光探针响应H2S[33-38]或者黏度[39-40]，但是能够同时检测黏度和硫化氢的探针很少.因此，迫切需要设计一种用于多种生物分子检测的荧光探针.Zhao 等[41]2018 年报道了一种基于荧光团氟硼吡咯的双功能荧光探针，能够同时响应细胞内黏度的增加和H2S的浓度变化.另外，Li 等[42]报道了一个能够靶向黏度和H2S 的双功能荧光探针.这些双功能荧光探针检测H2S 的机理主要是探针分子中叠氮化物被还原，从而造成了荧光出现的现象.然而，这些探针是被紫外光激发，并且叠氮化物会被紫外光分解，使得探针可能会产生错误的信号.因此，发展一种稳定性高的新型双功能荧光探针同时检测黏度和H2S 很有必要.

在本工作中，我们设计合成了一个可以同时响应黏度和H2S 的探针Mito-ANP，该探针以9-蒽甲醛作为荧光团.如图1 所示，由于在低黏度下，单键可以自由旋转，因此，探针分子的荧光可以忽略不计.随着体系黏度的增加，探针分子的转动受到限制，Mito-ANP的荧光强度在620 nm 处显著增加.同时，探针分子Mito-ANP中吡啶盐有很强的吸电子能力，可以与亲核试剂H2S 发生亲核加成反应[40]，探针的共轭体系从而被破坏，使得Mito-ANP的荧光发射波长从620 nm 蓝移到568 nm，实现了探针对黏度和H2S 的同时响应.另外，Mito-ANP对H2S 有很好的选择性和灵敏度，它对H2S 的最低检测限仅为12.89 nmol/L.Mito-ANP还能用于神经细胞中硫化氢和黏度变化的荧光成像.

图1 双功能荧光探针Mito-ANP 对黏度和H2S 的设计机理Fig.1 Rational design of a dual-function fluorescent probe Mito-ANP for viscosity and hydrogen sulfide

1 实验部分

1.1 试剂与仪器4-甲基吡啶、2-溴乙醇、9-蒽甲醛购自安耐吉化学剂有限公司；六氢吡啶购自上海泰坦科技有限公司；二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯和石油醚均购自天津欧博凯化工有限公司；三氯甲烷从成都市科隆化学品有限公司购进.0.054～0.077 mm（200～300 目）柱层析硅胶（青岛海洋化工公司）.所用试剂均为分析纯，使用时无需进一步的纯化.所用去离子水（≥ 18 MΩ·cm）由 Milli-Q纯化系统制备.

DF-101S 型集热式恒温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；RE-2000B 旋转蒸发器；循环水真空泵；FS5 荧光光谱仪（英国爱丁堡公司）；UV-2550 型紫外可见分光光度计（赛默飞公司）；Bruker AVANCE-400 MHz超导核磁共振波谱仪（德国）；布鲁克高分辨质谱仪.

1.2 探针Mito-ANP 的合成称取4-甲基吡啶（0.8 g) 置于圆底烧瓶中，在搅拌状态下缓慢加入2-溴乙醇（0.61 mL）（分子比为1∶1），在70 ℃下反应24 h 左右，TLC 跟踪反应 (V乙酸乙酯：V石油醚=1∶5).待反应完成后，用无水乙醇洗涤固体，并且用超声震碎固体，固体溶解.悬干溶剂后，将得到的果冻状液体置于冷冻液中，直至析出固体，得到1.7 g 化合物1，产率为87%.

称取0.5 g 化合物1置于圆底烧瓶中，加入适量三氯甲烷，超声震碎溶解，溶液呈白色浑浊液.然后加入6～7 滴六氢吡啶搅拌均匀后，再往溶液体系中缓慢加入9-蒽甲醛（0.51 g）（分子比为1∶1），在70 ℃下回流.溶液颜色变黄，回流10 min 左右，体系颜色逐渐加深至暗红色.反应24 h 左右，TLC跟踪反应 (V乙酸乙酯：V石油醚=1∶5).待反应完成后，悬干溶剂，用无水乙醇洗涤、抽滤、干燥得到0.85 g探针分子Mito-ANP，产率为84%.1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.04 (d,J=4 Hz,1H),8.99 (d,J=12 Hz,2H),8.72 (s,1H),8.56 (d,J=4 Hz,2H),8.39(d,J=8 Hz,2H),8.18 (d,J=8 Hz,2H),7.61 (m,4H),7.36 (d,J=12 Hz,1H),5.31 (t,J=4,8 Hz,1H),4.67(t,J=4,8 Hz,2H),3.92 (d,J=4Hz,2H)；13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ: 152.7，145.4，138.1，132.6，131.4，130.5，129.5，129.4，128.9，127.2，126.1，125.8，124.6，62.7，60.7.MS (C23H20NO)m/z实测值（计算值）: 326.152 7 [M].探针Mito-ANP的合成路线见图2.

图2 探针Mito-ANP 的合成路线Fig.2 Synthetic route of the probe Mito-ANP

1.3 荧光探针Mito-ANP 对黏度的光谱特性探针Mito-ANP用二甲基亚砜（DMSO）溶解，并且配置成10 mmol/L 的母液.不同黏度的液体使用磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）与甘油不同的比例制得.在测定荧光光谱时，将探针Mito-ANP的浓度稀释至5 μmol/L，在不同体积比例PBS 和甘油混合溶液中测试荧光发射强度.激发波长和发射波长的狭缝宽度都设置为5 nm.探究探针的荧光发射强度和溶液黏度的关系遵循福斯特方程[43]：LogIf=c+xLogη，其中If为荧光强度，η为黏度，x和c是常数.

1.4 荧光探针Mito-ANP 对硫化氢（H2S）的光谱特性硫化钠（Na2S·9H2O）用二蒸水稀释，配制成100 mmol/L 的母液作为硫化氢（Na2S）的来源.在测定荧光光谱时，把一定量的Na2S 和其他分析物加入到探针溶液中.测试时，将探针Mito-ANP的浓度稀释至5 μmol/L，所有的光谱测试都在CH3CN/PBS 的缓冲溶液中进行 (VCH3CN∶VPBS=1∶1，10 mmol/L，pH=7.4).探究探针Mito-ANP对不同氨基酸如半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）、赖氨酸（Lysine）、色氨酸（Tryptophan）、苏氨酸（Threonine）以及核苷酸（Nucleotide），维生素如维生素C（Vitamin C）、维生素D（Vitamin D），和各种阴离子如Br−、CI−、SO42−、SO32−、NO3−、NO2−的选择性实验时，将这些分析物用二蒸水配置成终浓度为1 mmol/L 的母液.激发波长和发射波长的狭缝宽度都设置为5 nm.

2 结果与讨论

2.1 探针Mito-ANP 对黏度的光谱响应如图3(a)，当体系的黏度从1.03×10−3Pa·s（100%PBS）增加到902.52 ×10−3Pa·s（90%甘油）时，探针Mito-ANP分子内扭曲转移电荷被限制，使得探针在620 nm 处随着黏度的增加，荧光强度逐渐增强，最大增强了8.5 倍左右.值得注意的是，如图3(b)，在黏度为1.03×10−3～954.52×10−3Pa·s 的范围内，根据福斯特方程（LogIf=c+xLogη），探针荧光强度的对数与黏度对数呈良好的线性关系，线性公式为y=0.105x+3.73，线性关系数R2=0.993.另外，在不同溶剂中，探针的荧光发射强度也不同.如图3(c)所示，在二甲基亚砜（DMSO）、甲醇，乙醇、乙腈、PBS 和甘油中，Mito-ANP的荧光强度增强仅在甘油中有显著的增强，而在其他溶剂中只有微弱的变化，这主要是归因于甘油的高黏度.以上数据说明，Mito-ANP对黏度有很好的响应.

图3 探针Mito-ANP 在不同体积比PBS -甘油溶液中黏度响应的荧光光谱、线性曲线及在不同溶剂中的荧光光谱Fig.3 Fluorescent spectra of Mito-ANP for viscosity in different volume ratios PBS-glycerol solution，linear graph and fluorescent spectra of Mito-ANP in different solvents

2.2 探针分子Mito-ANP 在不同溶剂中的绝对荧光量子产率如表1 所示，探针Mito-ANP在乙腈极性溶剂中的绝对荧光量子产率最高，因此选择乙腈作为测试探针响应硫化氢（H2S）的溶剂.

表1 不同溶剂中绝对荧光量子产率的对比Tab.1 A comparison of the absolute fluorescent quantum yield in different solvents

2.3 探针分子Mito-ANP 对H2S 的光谱响应如图4(a)所示，在CH3CN/ PBS 的缓冲溶液中(VCH3CN∶VPBS=1∶1，10 mmol/L，pH=7.4)，随着不同浓度Na2S 的加入，探针Mito-ANP的荧光强度在568 nm 处的荧光强度逐渐增强，说明探针Mito-ANP对H2S 有很好的响应.同时，如图4(b)所示，在0～25 μmol/L范围内，探针的荧光强度与Na2S的浓度呈良好的线性关系，其线性公式为y=618.13x+6 150.31，R2=0.994).根据LOD=3Sb/k公式计算得到探针Mito-ANP对H2S 的最低检测限仅为12.89 nmol/L.

图4 探针Mito-ANP 在测试体系中的荧光光谱和线性曲线Fig.4 Fluorescent spectra of Mito-ANP in test system and linear graph

2.4 探针Mito-ANP 对H2S 的反应选择性和pH依赖性探针的选择性和pH 依赖性是评价探针在生理条件下准确检测H2S 的前提.因此，我们测试了探针Mito-ANP对H2S 的选择性和pH 依赖性.如图5(a)所示，只有加入Na2S 才能引起探针的荧光强度增加，而其他氨基酸（如Cys，Hcy，GSH，Lysine，Tryptophan，Threonine），以及核苷酸（Nucleotide），维生素（如Vitamin C，Vitamin D）和其他阴离子（如Br−、CI−、SO42−、SO32−、NO3−、NO2−）的加入只能引起探针荧光强度的微弱变化.在pH 测试中，Mito-ANP在pH 值为4～10 的范围内，荧光强度在568 nm 处稳定性很好，不受酸碱体系的影响，见图5(b).当加入Na2S 后，随着pH 值的增加，探针的荧光强度在568 nm 处明显增强，这是由于Na2S 在碱性环境中具有较高的亲核性.上述结果表明，探针Mito-ANP对H2S 有专一的选择性和良好的pH 耐受性.

图5 探针Mito-ANP 在测试体系中的选择性荧光柱状图和pH 响应Fig.5 The fluorescent intensity of Mito-ANP with Na2S and other analytes in test system and pH response

2.5 探针分子Mito-ANP 对H2S 检测的识别机理研究为了进一步验证推测的机理（图1），即探针Mito-ANP与Na2S 发生亲核加成反应[图6（a）]，我们利用高分辨质谱滴定实验验证.如图6(b)所示，特征峰m/z为360.141 66，这是归因于[(Mito-ANP) +SH]的分子离子峰，与之前文章报道的反应机理相类似[40].以上结果说明，探针Mito-ANP与Na2S 发生亲核加成反应.

图6 探针Mito-ANP 对H2S 的响应机制和反应前的高分辨质谱图Fig.6 The proposed response mechanism of Mito-ANP towards H2S and HRMS spectra of Mito-ANP before reaction

2.6 探针分子Mito-ANP 在帕金森疾病疾病模型中的应用帕金森病是一种慢性神经退行性疾病，与生物硫醇如还原型谷胱甘肽（GSH），半胱氨酸（Cys）和高半胱氨（Hcy）水平密切相关[44-45],这些生物硫醇在细胞内可以被代谢产生硫化氢[46].为了探究探针Mito-ANP在帕金森疾病模型中的应用，我们首先用6-羟基多巴胺（6-OHDA）处理神经细胞PC12 建立帕金森病细胞模型.结果如图7 所示，当PC12 细胞与探针Mito-ANP（10 μmol/L）共孵育时，细胞在绿色通道有较强的荧光.然而，PC12 细胞被6-OHDA 预处理后，绿色通道荧光强度下降显著并且伴随部分细胞死亡.这个结果表明帕金森症的病理生理和病理过程与硫化氢的消耗密切相关.

图7 Mito-ANP 在帕金森疾病模型中的应用Fig.7 Application of Mito-ANP in Parkinsons disease model

接下来，我们研究了Mito-ANP对PC12 细胞黏度的响应.制霉菌素可通过破坏子平衡，诱发线粒体结构改变，从而导致线粒体黏度明显增加[47].结果如图8 所示，当PC12 细胞与探针Mito-ANP（10 μmol/L）共孵育时，细胞在红色通道有微弱的荧光.当PC12 细胞被制霉菌素预处理后，红色通道荧光强度显著增强.这个结果表明Mito-ANP可以特异性地检测线粒体黏度.

图8 Mito-ANP 对PC12 细胞黏度的响应Fig.8 Response of Mito-ANP to PC12 cell viscosity

3 结论

本文设计合成了一个同时靶向黏度和H2S 的荧光探针Mito-ANP.随着体系黏度的增加，探针Mito-ANP分子内扭曲转移电荷被限制，荧光强度从而逐渐增强.另外，探针Mito-ANP还能够与H2S 发生亲核加成反应，它对H2S 的最低检测限仅为12.89 nmol/L，说明该探针对H2S 检测的灵敏度很高.同时，探针对H2S 也具有很好的选择性.更重要的是，探针Mito-ANP还能成功地用于神经细胞中硫化氢和黏度变化的荧光成像.这项工作提供了一种新型荧光探针，它能够靶向黏度和H2S，也为早期发现阿尔兹海默疾病提供了一种可能方法.