肝细胞癌免疫治疗生物标志物的研究进展

黄孙桦 刘建东 黄罡

作者单位：201800 上海 海军军医大学第三附属医院普外科

肝细胞癌(HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。2020年Globocan数据显示,HCC是全世界发病率排名第六的癌症,也是排名第三的癌症致死原因[1-2]。2022年中国肿瘤年报数据显示,中国每年大约有38万余例肝癌新发病例和33万余例肝癌死亡病例[3]。由于起病隐匿,早期症状不典型,大约39.0%～53.6%的HCC患者确诊时已处于中晚期[4],预后较差[5- 6],自然条件下中位生存期仅半年[7],治疗后中位生存期2年左右[5, 8],总体5年生存率约18%[2],即便能手术切除,术后5年复发和转移的患者高达70%[9]。

近年来HCC的治疗手段越来越丰富,靶向治疗和免疫治疗已成为HCC的重要治疗手段。免疫药物种类主要包括:程序性死亡蛋白受体1(PD-1)抑制剂和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)抑制剂。 由于对免疫治疗的反应取决于肿瘤分子特征、肿瘤微环境(TME)组成以及先天免疫和适应性免疫机制之间复杂的动态相互作用[10],因此如何预测其疗效显得尤为重要。目前,FDA已批准的针对多种实体瘤的免疫治疗生物标志物有三种,分别是肿瘤突变负荷(TMB)、DNA错配修复(MMR)/微卫星不稳定(MSI)以及PD-L1[11],但HCC并不在这些被批准的实体瘤范围之内。免疫治疗在HCC中的疗效差异较大,关于HCC免疫治疗疗效预测相关的生物标志物的报道亦有很多,但尚未有达成共识的有效生物标志物,本文就HCC免疫治疗疗效相关生物标志物的研究进展进行综述。

一、肿瘤组织内生物标志物

(一)PD-L1 PD-1和PD-L1属于免疫检查点蛋白家族。PD-1主要表达于各种免疫细胞,PD-L1在多种正常和免疫细胞上表达,如树突状细胞、活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞以及巨噬细胞等。它们的相互作用在调节免疫系统中起着“刹车”作用,以减少过度炎症和自身免疫反应。然而,肿瘤细胞也能通过在肿瘤细胞表面表达PD-L1来实现免疫逃逸[12]。

(二)TMB TMB指肿瘤基因组去除胚系突变后的体细胞突变数量,通常以每兆碱基中发生基因缺失、插入或置换的突变总数表示[13]。全外显子组测序(WES)被认为是TMB检测的金标准,但其成本高、周期长,不适用于临床常规诊断。因此,第二代测序(NGS)被推荐为一种更简单、便宜的TMB检测方法。

(三)MMR/MSI MMR基因经转录翻译后表达相应的错配修复蛋白,常见的MMR蛋白包括MutL homolog 1 (MLH1)、MutS protein homolog 2 (MSH2)、MutS homolog 6 (MSH6)和 PMS1 homolog 2 (PMS2),其中任一MMR蛋白的缺失可造成细胞的错配修复功能缺陷,导致DNA复制过程中碱基错配累积,从而引起MSI的发生,增加肿瘤发生风险[14]。

(四)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) TIL指浸润于肿瘤组织中发挥抗肿瘤作用的淋巴细胞,是肿瘤免疫微环境中最常见和最重要的组成部分。有研究表明在实体瘤中TIL浸润程度增加与PD-L1表达上调及临床获益相关[15]。TIL直接影响免疫微环境,不同TIL在HCC中的变化与作用是未来其作为免疫生物标志物的重要探索方向。

(五)肿瘤异质性指标 同一患者不同位置肝癌组织存在不同程度的异质性。Bojan等通过整合了多地区肝癌RNA高通量测序(RNA-seq)、DNA测序、T细胞受体测序(TCR-seq)和单核苷酸多态性(SNP)检测的数据研究肿瘤内异质性,发现TME中淋巴细胞浸润程度与HCC内部异质性相关,肿瘤异质性越高,免疫浸润程度越大,对免疫治疗越敏感[16]。

(六)CTNNB1基因 β-catenin作为一种黏附连接蛋白,由CTNNB1基因编码。有研究表明,在HCC中CTNNB1 基因突变可导致免疫细胞浸润不良,从而对免疫治疗敏感性下降,即“冷肿瘤”[17];而无CTNNB1突变者,免疫细胞浸润良好,称为“热肿瘤”。CTNNB1 基因突变可能与免疫细胞的浸润不良有关[18]。因此,CTNNB1可能是预测 HCC 免疫疗效的有效生物标志物之一。

(七)11基因集标志物(IFNAP) Haber等[19]报道了一项多中心研究的结果,分析了来自美国和欧洲的13个中心的83例HCC样本,所有样本都是在开始ICIs单药治疗之前获得的,并进行了转录分析。作者发现了一个11基因集的标志物(IFNAP),包括参与干扰素γ信号的STAT1、GBP1,参与抗原提呈的B2M、HLA-DRB5、HLA-DRA,参与趋化的CXCL9,以及CTSS、FCER1G、HLA-DQA1、SEC24A、TRIM25,该基因集能够预测一线接受ICIs治疗的患者的放射反应和总生存期。但该研究样本量较小,有待进一步扩大样本证实。

(八)其他 解整合素金属蛋白酶(ADAM)属于一类跨膜蛋白分子,参与多种细胞功能,比如细胞黏附、细胞迁移和肿瘤发生等,其中包括参与HCC的肿瘤进展[20]。ADAM9是ADAM家族之一,有研究表明ADAM9在HCC中表达上调,且与HCC进展和预后不良有关[21-22]。因此,ADAM9也可能是一种潜在的预测免疫疗效的生物标志物[23]。

二、肿瘤组织外生物标志物

(一)外周血中生物标志物 肿瘤组织活检获取是一个复杂、困难及有创的过程,而血液是一种快速、无创、可重复且易于获取的生物组织标本。所以外周血中生物标志物的检测是一种更简易、更快速、更安全、可重复性更高的方法。

1.外周细胞因子:有研究通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定不可切除HCC患者在派母单抗治疗后的血浆转化生长因子-β(TGF-β),结果表明低基线TGF-β与OS和PSF改善相关,基线TGF-β≥200 ng/L的患者mOS和mPSF分别为7个月和2个月,而基线TGF-β<200 ng/L患者mOS和mPSF均>25个月[24]。可以推测外周血低水平的TGF-β也许能通过促进HCC中T细胞的聚集移位来提高免疫疗效。

2.外周免疫细胞:T细胞是ICIs的主要靶点,外周T细胞受体(TCR)可作为循环血液中对ICIs反应的生物标志物[25]。CD4+和 CD8+T 细胞的活化状态可以预测黑色素瘤患者对ICIs的反应[26]。中性粒细胞与淋巴细胞比值的升高与非小细胞肺癌对纳武利尤单抗治疗后 PFS 和 OS 的降低相关[27]。然而目前缺乏外周免疫细胞在HCC免疫治疗后变化的相关研究,但免疫细胞作为免疫过程直接参与者,为我们指出了未来研究的方向。

3.循环肿瘤DNA(ctDNA):ctDNA携带着肿瘤相关基因全部的突变信息,能更精准、全面地提示肿瘤负荷,从而更好地预测免疫反应[28]。多数晚期HCC患者的肿瘤为多灶性,活检样本难以反映肿瘤全貌,ctDNA恰好能解决这些问题。所以如果能解决HCC ctDNA的区分问题,其将会是一种值得期待的HCC外周血免疫疗效预测生物标志物。

4.甲胎蛋白(AFP):AFP是临床常用的诊断HCC的血清肿瘤标志物,大约70%的HCC患者AFP升高。2019年首次出现有关AFP与免疫治疗疗效相关性的报道,研究中早期 AFP 反应被定义为治疗开始后 4 周内血清 AFP 水平较治疗前下降 >20%。高AFP基线患者可能获得更好的免疫治疗疗效[29]。所以AFP除了作为传统的HCC诊断标志物,可能也能反映HCC免疫疗效,但其机制需进一步研究。

5、可溶性PD-L1(sPDL-1):PD-L1蛋白膜裂解释放出的可溶性的PD-L1为sPD-L1,在外周血中可检测到,具有与PD-1受体结合的能力[30]。采用ELISA检测外周血中的sPD-L1比组织活检更方便[31]。sPD-L1可能与PD-L1一样在晚期HCC 中免疫预测作用欠佳,其能否作为可靠的HCC外周血免疫生物标志物需进一步的研究。

(二)肠道微生物群 肠道和肝脏通过门静脉系统相互关联,肝脏不仅接受血液中来自肠道的营养物质, 也暴露于肠道菌群及其代谢产物[32]。许多研究发现,肠道菌群对HCC的治疗有着重要影响,肠道菌群及其代谢产物可能与HCC免疫治疗反应有关[33]。

(三)靶向联合免疫治疗疗效的生物标志物 最近对临床试验中接受阿替利珠单抗(atezolizumab)联合贝伐珠单抗治疗的HCC患者进行生物标志物分析发现,与atezolizumab单药治疗相比,Treg浸润严重的患者从联合治疗中获益更大,表明ICIs与抗血管生成药物联用可能有助于克服严重Treg浸润导致的ICIs单药治疗耐药。

ICIs是目前临床上治疗晚期HCC的重要方法之一,但由于对ICIs的反应取决于肿瘤分子特征、肿瘤微环境、先天和适应性免疫相互作用等复杂因素,ICIs在不同恶性肿瘤、甚至相同组织学的肿瘤之间反应差异很大,并且大多晚期HCC本身存在肿瘤异质性,所以晚期HCC对ICIs的治疗反应差异较大,因此其疗效的预测生物标志物显得尤为重要。

通过更易于获取的外周血中生物标志物的检测来预测ICIs反应亦是近年来的研究热点,例如CtDNA便是其中的重点之一,已在肺癌、乳腺癌等多种实体瘤中证实了其免疫预测价值,但在HCC中其主要挑战是寻找确切的靶点和标志物区分肿瘤ctDNA和正常细胞游离DNA。sPD-L1由PD-L1裂解释放,其在HCC免疫预测中的实际价值如PD-L1一样所受影响因素较多。此外,在外周血淋巴细胞和细胞因子的研究中发现,TGF-β可以通过驱逐肿瘤中CD8+T细胞来减弱肿瘤对PD-L1抑制剂的反应,TGF-β也许能成为HCC的有效外周血免疫预测标志物。除外周血以外,动物研究中肠道菌群及其代谢产物可能与HCC的免疫激活相关,其在人体的预测作用有待进一步研究。

综上所述,现有的生物标志物对晚期HCC免疫治疗反应的预测价值尚未明确。靶免联合是HCC治疗的重要方向,目前靶免联合方案是晚期HCC的一线方案,对靶免联合治疗相关的生物标志物的探索甚至更为重要。此外,单个生物标志物并不是预测免疫治疗反应的完美指标,未来需要更多的研究来综合评估这些免疫生物标志物,甚至建立综合评分机制来更全面地评估免疫疗效。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。