N,N-二甲基甲酰胺对炔雌醚不育作用和适口性的影响

秦 姣，姜洪雪，刘全生

（1.广东省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640；2.广东省科学院动物研究所，广东 广州 510260）

【研究意义】近年来，国内对不育剂治理害鼠开展了大量系统的研究和应用工作，一方面，不育技术可以有效地解决抗凝血杀鼠剂存在的防治效果持续时间短、抗药性个体和种群增加以及误伤非靶标动物等问题；另一方面，避免了因化学灭杀导致种群数量的急剧缩小，从而引起生态系统失衡［1-3］。已有许多研究证实炔雌醚（Quinestrol）、左炔诺孕酮和炔雌醚复合剂（EP-1）可有效控制多种野鼠的繁殖，其中，炔雌醚为甾体类雌激素，其活力是乙炔雌二醇的8～10 倍，不育活性很高。此外，炔雌醚口服后经消化道吸收贮存于体内脂肪，转变为炔雌醇缓慢释放，药效可持续1 个月以上，可以达到很好的长效避孕作用［4］。对布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）、长爪沙鼠（Meriones unguiculatus）、东方田鼠（Microtus fortis）和大仓鼠（Tscherskia triton）等鼠的不育效果显著［5-13］。然而炔雌醚难溶于水，渗透力较差，鼠类对浸泡法和粘附法制作的炔雌醚药饵摄食量较低［11-14］。因此，保证不育剂的控制效果、提高不育药物的利用率、节约害鼠防控成本以及降低生态风险成为亟待解决的问题。【前人研究进展】国内学者通过混合不育剂与饵料粉剂制成颗粒饵料来提高炔雌醚的适口性［15］，或通过物理作用完成2-羟丙基-β-环糊精对药物的包合作用来提高其水溶性［16］。但在温热潮湿的南方地区，鼠类多以稻谷作饵料。因稻壳的阻滞和吸附，鼠药很难渗入米粒，导致鼠类摄入的药物有效浓度较低［17］，严重限制了药效的发挥。

【本研究切入点】针对炔雌醚难溶于水、适口性较差、稻谷药饵利用率低等问题，研究添加农药助剂或（和）改变药饵配制方法等手段［18］，以提高稻谷药饵的利用率。N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）是一种用途极广的优良溶剂，能溶解多种有机化合物和无机化合物，可吸附各种气体，在农药领域中常用于合成高效低毒农药杀虫剂［19］。【拟解决的关键问题】本研究通过优化使用DMF 溶解炔雌醚的方法，以提高炔雌醚对饵料的渗透性并改善其对鼠类的适口性。测定DMF 溶解炔雌醚后配制的药饵对实验鼠的适口性和不育效果，并比较分析不同配制方法对炔雌醚在谷壳和糙米中的分布影响，为害鼠不育剂的减量增效提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物：供试昆明小白鼠购自广东省医学实验动物中心。

主要试剂：炔雌醚（购自北京市紫竹天工科技有限公司，纯度＞99%），炔雌醚标准品（供含量测定用，按C25H32O2计，含量为98.6%），甲醇和无水乙醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

仪器设备：Agilent 1260 高效液相色谱仪，可变波长紫外检测器，色谱柱：Agilent C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 试验方法

试验于2019 年6 月至2020 年3 月在广东省科学院动物研究所进行。

1.2.1稻谷药饵和空白饵料的配制 将20 mL Tween-80 加入1 000 mL 纯净水中混匀后，再加入1.5 g 炔雌醚，磁力搅拌至完全溶解。称取新鲜稻谷3 kg，加入配制好的炔雌醚溶液1 000 mL，搅拌均匀，浸泡10 h 后晾干，制得0.05%炔雌醚药饵；秤取炔雌醚1.5 g，加入DMF100 mL，搅拌至完全溶解；将20 mL Tween-80 加入1 000 mL纯净水中混匀；将含有炔雌醚的DMF 溶液倒入Tween-80+水的溶液中，搅拌混匀，配制成炔雌醚母液，配制0.05%DMF-炔雌醚药饵（方法同上）；将20 mL Tween-80 加入1 000 mL 纯净水中搅拌混匀，再加入3 kg 新鲜稻谷，搅拌均匀，晾干，制得空白饵料。

1.2.2小鼠对不同饵料取食量的测定 选择成年（4 月龄）、健康、非孕、无外伤的雄、雌小鼠各24 只，分别单笼饲养于不透明的塑料鼠笼中（30 cm×15 cm×20 cm），自由取食［标准鼠饲料，广东省医学实验动物中心生产，SCXK（粤）2013-0002］和饮水，室温保持在25（±2）℃，饲养房光照保持12L ∶12D(8：00 —20：00)。雄、雌鼠随机分为3 组［空白饵料处理，C；炔雌醚药饵处理，T1；DMF-炔雌醚药饵（简称DMF-炔）处理，T2］，每组8 对，体重差异不显著（雄鼠：35～44 g；雌鼠：29～37g）。先以纯稻谷饲养1 周，此后每天给C、T1 和T2 组的每只鼠分别投放20 g空白饵料、炔雌醚药饵和DMF-炔药饵，每隔3 d称体重，收取剩余饵料烘干称重（3 d 累计摄食量计为1 次）（±0.1 g），更换新饵。摄食实验持续9 d 后，清除药饵，改用正常饲料饲养。

1.2.3不同饵料对小鼠繁殖力的影响 不同饵料饲喂小鼠试验结束后，分别将3 个处理组的每对雄、雌鼠合笼，合笼期间正常饲料喂养。合笼7d后将雄鼠断颈处死，取睾丸和肾脏称重。记录每组雌鼠怀孕及产仔情况。

1.2.4谷饵中炔雌醚含量测定 采用高效液相色谱法，流动相：甲醇-水（90∶10）；流速：1.0 mL/min；检测波长：279 nm；进样量：20 μL；柱温：30℃。秤取炔雌醚标准品，用甲醇溶液配制成浓度为10、20、30、40、50、60 μg/mL 的炔雌醚标准工作液。分别吸取20 μL 不同浓度的炔雌醚标准工作液进样分析，以对照品进样量为横坐标X、色谱峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线，得到回归方程：Y=5.612X-3.02（R2=0.9999）。称取10 g炔雌醚药饵、DMF-炔药饵各3份，分离药饵（稻谷）为糙米和稻壳，糙米用粉碎机研磨粉碎。甲醇溶液反复多次溶解，过微孔滤膜，上机进行测定（回收率＞90%）。分别计算炔雌醚药饵和DMF-炔药饵糙米和稻壳中炔雌醚含量。

1.3 统计分析

文中数据以平均值±标准误（Mean ± SE）表示，检验正态性和齐次性。以One-way ANOVA检验鼠对不同饵料的摄食量以及不同处理组鼠体重和内脏器官鲜重的差异。以配对样本T检验比较不用药饵中炔雌醚浓度差异；采用Least Significant Difference test（LSD）检验组间差异。雌鼠产仔率和存活子代个体数差异用卡方检验（Chi-Square Test）。数据采用 SPSS 18.0 软件统计分析，P＜ 0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 DMF 对小鼠摄食的影响

由图1 可知，3 组雄、雌性小鼠对不同饵料的摄食量差异显著（P＜0.05），T1 和T2 组雄性小鼠对饵料的取食量均低于C 组，且雄性小鼠第6 d 对炔雌醚药饵的摄食量为DMF-炔药饵摄食量的1.2 倍（P=0.047）。T1 和T2 组雌性小鼠对饵料的取食量均低于C 组，且雌性小鼠对炔雌醚药饵的摄食量与对DMF-炔药饵的摄食量差异不显著，表明饵料中添加DMF 并不影响雌鼠的取食量。

图1 小鼠对不同饵料的摄食量比较Fig.1 Comparison of food consumption of different baits of mice

2.2 DMF 对小鼠体重和内脏器官的影响

2.2.13 种饵料对小鼠体重的影响 3 组雄、雌性小鼠取食不同饵料后体重差异均显著（P＜0.05）（图2）。T1和T2 组雄性和雌性小鼠体重均显著低于C 组（P＜0.05），但雄、雌性小鼠取食炔雌醚药饵后的体重与取食DMF-炔药饵后的体重差异不显著。表明在炔雌醚药饵中添加DMF 并不影响雄、雌鼠的体重。

图2 不同处理组小鼠体重比较Fig.2 Comparison of body weight of mice in different treatment groups

2.2.23 种饵料对雄鼠内脏器官的影响 3 组不同饵料饲喂的雄性小鼠处死后，取睾丸和肾脏称重，结果如图3 所示，T2组雄性小鼠睾丸鲜重显著低于T 1组和C 组（P＜0.05）；T1 组和T2组鼠肾脏器官鲜重分别比C 组显著低16.4%和19.7%(P＜0.05)。

图3 不同处理组雄性小鼠内脏器官鲜质量比较Fig.3 Comparison of wet weight of visceral organs from male mice in different treatment groups

2.3 DMF 对炔雌醚不育效果的影响

试验期间C、T1、T2 组雌鼠繁殖后代情况如表1 所示，结果表明，炔雌醚对雌性小鼠的繁殖有明显的抑制作用，T1组和T2 组产仔率降低至37.5%和25.0%。T1 组和T2 组的产仔数仅为C组的35.0%和11.1%。各组子代小鼠的存活数差异显著（χ2=8.12，P=0.017）。

表1 不同处理组雌性小鼠繁殖能力比较Table 1 Comparison of breeding performance of female mice in different treatment groups

2.4 DMF 增加炔雌醚渗透的作用

10 g 炔雌醚药饵和DMF-炔药饵样品中炔雌醚含量如表2 所示，结果显示炔雌醚药饵中稻壳含药量占总药量的91.7%，糙米含药量占总药量的8.3%；DMF-炔药饵稻壳含药量占总药量的87.2%，糙米含药量占总药量的12.8%。DMF-炔药饵糙米中炔雌醚的含量为炔雌醚药饵糙米中的1.5 倍（t=-2.121，df=2，P=0.101），DMF-炔药饵稻壳中炔雌醚的含量显著低于炔雌醚药饵稻壳中炔雌醚的含量（t=3.674，df=2，P=0.021）。

表2 两种药饵在糙米和稻壳中的炔雌醚含量Table 2 Content of quinestrol in brown rice and rice husk in two kinds of bait

3 讨论

炔雌醚在控制害鼠繁殖方面的效果显著，但其水溶性较低且适口性较差，本研究利用添加DMF 的方法对炔雌醚药饵进行优化配制。结果表明，雄、雌鼠对炔雌醚药饵（包括DMF-炔药饵组）和空白饵料的摄食量存在显著差异，前者的取食量明显低于后者。有研究表明，炔雌醚会降低鼠类对饵料的食欲，例如高原鼠兔（Ochotona curzoniae）和黑缘齿鼠（Rattus andamanensis）对炔雌醚药饵的摄入量均显著下降［11,15］。部分鼠类对炔雌醚药饵的取食量存在性别差异。雄、雌鼠对炔雌醚药饵摄食量的变化趋势不同。如黄毛鼠连续取食炔雌醚饵料3～4 d 后，雄鼠取食量显著降低［14］，而雌鼠取食炔雌醚药饵与空白饵料之间并不存在差异。本研究中雄、雌鼠对含炔雌醚药物的饵料取食趋势一致，均低于空白饵料组。推测这种性别差异可能与不同物种/个体间嗅觉和味觉等生理特征差异有关［20］，其内在机制仍需要进一步深入探究。

炔雌醚药饵组和DMF-炔药饵组的雄、雌鼠体重显著低于空白饵料组，可能由这两组鼠摄食量减少导致。炔雌醚对雌鼠有明显的繁殖抑制作用，与空白饵料组相比，用药组小鼠产仔数和存活数显著降低，且DMF-炔药饵对雌鼠繁殖抑制作用更为明显，饲喂后的雌鼠繁殖率降低至25%，且产仔数仅为对照组的11%、炔雌醚药饵组的32%。炔雌醚对雄鼠的睾丸和肾脏鲜重也有明显影响，特别是DMF-炔药饵组雄鼠睾丸明显萎缩。已有研究表明，除了抑制雌性生殖进程外，炔雌醚还能干扰雄性的生殖功能［4，20］；可引起雄性睾丸、附睾和精囊腺萎缩，并导致精原细胞、精子细胞以及睾丸间质细胞凋亡［21-24］。繁殖器官的萎缩也伴随着LH、T 等激素水平下降，精子数量和质量降低，以及生育率下降［21，23］。此外，炔雌醚还可以降低雄鼠肾脏鲜重，这与王宇杰等［25］使用剂量为5.0 mg/kg 的炔雌醚对雄性小鼠灌胃，小鼠肾脏系数显著低于对照组的结果一致，炔雌醚对肾脏的影响可能与肾脏参与雌激素代谢有关，其功能受损或逐渐衰退，炔雌醚对肾脏的影响机制尚待研究。

添加DMF 能显著提高炔雌醚在糙米中的含量，达到传统配制（炔雌醚药饵组）中含量的1.5倍；此外，本研究还对不同配制方案下炔雌醚药饵中稻壳和糙米的含药量占比进行了测算，结果显示炔雌醚药饵中谷壳药物浓度为糙米的10 倍，鼠类取食的炔雌醚药饵药物浓度仅为配制浓度（0.5 mg/g）的8.3%。通过添加DMF 助剂，药物浓度可提高至配制浓度（0.5 mg/g）的12.8%，该结果为准确估算鼠类实际摄入量提供了测算依据，并为制定更为科学精准的浓度提供了参考。

4 结论

本研究结果表明，选用DMF 作为助溶剂，不仅可以快速有效地溶解炔雌醚，而且增加鼠类取食部分（糙米）的药物浓度至传统配制的1.5 倍。同时，增强了炔雌醚对于雄、雌鼠的不育效果，使雌鼠繁殖率降低至对照组的25%，且繁殖个体数显著减少，产仔数仅为对照组的11.1%。因此，DMF 作为助剂对炔雌醚药饵有显著的增效作用，可用于开发具有良好应用前景的不育剂配方，实现对农田鼠害的经济、有效和可持续综合管理。