基因增强骨组织工程中脂肪干细胞成骨的研究进展

郭栋,时静,李文晋,3*

(1.山西医科大学口腔医学院·口腔医院,山西 太原 030001;2.天津医科大学第二医院口腔科,天津 300070;3.山西医科大学第二医院口腔科,山西 太原 030001)

对于外伤、肿瘤等疾病所引起的骨折,骨修复一直是一个极大的难题。传统疗法骨再生率低,也会造成慢性疼痛和感染[1]。基因增强骨组织工程融合了基因治疗与骨组织工程技术的优点,在骨修复领域具有良好的前景。近年来脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)逐渐引起人们的关注,成为基因增强骨组织工程中更有前景的干细胞。本文就ADSCs在基因增强骨组织工程中的研究进展做一综述,为后续研究提供理论支持。

1 ADSCs与骨组织工程

骨组织工程的主要目标是将种子细胞、生长因子、复合支架结合起来,产生模拟细胞外基质的结构,促进组织修复和再生[2]。

1.1 ADSCs与生长因子 种子细胞的常规来源是骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),但其应用仍存在不少问题,如BMSCs提取时所带来的痛苦、提取的干细胞产量低、干细胞特征的不稳定、分化潜能发生变化、需要额外补充生长因子来促进成骨以及骨折的不完全愈合等[3-5]。ADSCs来源于丰富的脂肪组织,最早由Zuk等[6]在脂肪组织的血管基质片段中分离得到。ADSCs已证明具有多系分化能力,包括成脂肪、成软骨、成肌和成骨谱系,已在体内用于再生脂肪、软骨、骨以及更复杂的组织,如牙周组织和椎间盘;还可以分化为内皮细胞,可以作为血管化骨组织工程的单细胞来源[7];它也是一种良好的基因载体细胞,易于接受基因修饰来获得成骨诱导功能的定向加强[8]。在下颌骨缺损、颅骨缺损治疗、膝关节、髋关节以及软骨修复等方面均取得了较为理想的进展[9]。它的优势在于：(1)ADSCs占脂肪组织中有核细胞总数的5%,可以高产量获得,而骨髓中的BMSCs不到0.01%;(2)ADSCs的收集程序相对简单、无痛,且并发症有效降低;(3)ADSCs在培养期间能保持较高的增殖潜能,平均群体倍增时间为2～3 d;(4)没有遗传改变或复制性衰老,即使是长达20代的长期培养,也不会引起ADSCs的显著染色体畸变,并保留其形态、免疫表型、正常分裂周期及其凋亡调节功能。冷冻保存超过10年,也不会影响它们的生存能力、分化潜能和免疫表型特征[10]。

生长因子可以诱导干细胞和炎症细胞迁移到损伤部位,通过自分泌或旁分泌机制促进骨形成,这些因子也会增加瘢痕形成,加速愈合过程。目前常用的生长因子有转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)等[2]。BMP-2是骨形态发生蛋白家族中最具骨诱导性的成员,是目前美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的第一个,也是唯一一个用作骨移植替代物的骨诱导生长因子,在碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OC)等成骨标志物的表达中起关键作用[11],可以显著增强ADSCs体内以及体外的成骨分化能力[12]。多个生长因子也可以一起转导,从而协同调节内源性蛋白质合成,增强生物活性。有学者用 IGF-1和BMP-2的构建物转染ADSCs,发现IGF-1和BMP-2驱动了ADSCs的软骨形成,促进ADSCs分化为成熟的软骨细胞样细胞和形成软骨结节[13]。

1.2 ADSCs与复合支架 支架设计目的是促进细胞增殖、存活、黏附、迁移以及加速骨重塑,其必须具有生物相容性和非细胞毒性,并且具有与骨组织相似的机械和表面性质。

在某些情况下还可以作为生长因子或抗生素的载体材料,与生长因子结合后为生长因子提供一定的机械强度,使生长因子持续缓释,可增加其在生物体内的浓度,刺激细胞的黏附[14]。支架材料多分为天然聚合物、合成聚合物和陶瓷材料三种,但均存在一定的不足,其微观结构的变化会影响间充质干细胞的反应,并可能改变细胞与支架表面的黏附、细胞增殖和成骨分化。目前研究人员常将两种或者两种以上的材料通过物理、化学混合或改性的方式来提高其力学和生物学特性,保留其各自的优势,以获得良好性能[15]。

天然聚合物具有良好的生物相容性,包含特定的分子结构域,可在细胞发育的各阶段支持和引导细胞分泌更多相关的细胞外基质,从而增强支架与组织的相互作用。常用的天然聚合物有多糖、胶原(collagen,Col)、海藻酸盐(sodium alginate,Alg)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)等材料[16]。也可添加其他诱导剂来增强成骨,如Wu等[17]在HA涂层孔或富含HA的纤维蛋白水凝胶中用辛伐他汀处理ADSCs可促进ADSCs的软骨分化。天然聚合物与陶瓷材料相比质地较软,可适应所需形状的要求,但存在降解速率过快、机械性能交叉等问题,因此可与骨组织工程中其他更为坚固的材料联合应用。

合成聚合物是一种半结晶的可生物降解聚合物,属于一种疏水性材料,其优势在于具有生物相容性、非细胞毒性、降解性能和可调节的机械性能,常用的材料有聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]和聚己内酯(polycaprolactone,PCL)。但由于其生物活性低,影响细胞附着、骨传导和骨诱导[18]。因此有学者将多种材料联合应用,如通过同轴静电纺丝制备了PLGA/PCL-BMP-2(PP-B)纤维支架,将ADSCs种植在支架上,与传统的PLGA/PCL支架在支架形态和BMP-2释放能力方面进行了比较,发现复合支架显著促进了ADSCs的增殖和成骨分化,PP-B组次之,传统的PLGA/PCL支架增殖和成骨能力最差[19]。

陶瓷材料也称为生物吸收性材料,其最大优势在于生物相容性好,具有合适的刚度、优异的骨传导性和骨诱导性、耐化学腐蚀特性,可促进生物矿化。但其脆性大,多与其他材料联合使用,其中最常用的是β-磷酸三钙(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)和羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)[20]。在一项BMP-2修饰的ADSCs负载于β-TCP载体植入犬尺骨缺损模型的实验中,发现新形成的骨体积显著增加,16周后缺损处的骨修复基本完成[21]。HAP也常与胶原结合,对胶原处理和BMP-2结合后的多孔HAP支架进行表面改性后对HAP支架的整体性能没有影响,但极大的增强了HAP支架的抗压能力。HAP、改性HAP和胶原-BMP-2功能化HAP的抗压强度依次递增,胶原蛋白和BMP-2的联合应用效果更佳[22]。Liao等[23]通过低温法构建明胶/HAP/BMP-2(GNB)支架,发现GNB支架可以通过上调早期标记蛋白Ⅰ型胶原蛋白和晚期标记蛋白骨桥蛋白,使得ADSCs碱性磷酸酶活性和矿化程度的升高,达到较为理想的成骨效应。

2 ADSCs与基因治疗

基因治疗分为体内法和体外法,体外法的原理是通过外源性基因转染从机体上分离出靶细胞并进行体外培养,然后再转移到缺损部位进行骨诱导修复;体内法的原理是将目的基因注入机体,使其在体内转染细胞并进行表达。两种方法均可持续输送少量、生理性强的BMP-2,大大减少所需的BMP-2数量,为机体提供持久的骨再生刺激,将不良反应的发生率降到最低[24]。目前常用的基因导入载体包括病毒载体和非病毒载体两大类,病毒载体如反转录病毒、慢病毒(lentiviru,Lv)、腺病毒(adenovirus,Ad)、腺相关病毒等;非病毒载体如脂质体、阳离子多聚物、壳聚糖、无机纳米粒子等[25]。

Ad具有易制备、高滴度、感染效率高、宿主细胞范围广、不整合至宿主细胞染色体内、在表达时间上具有自限性、遗传毒性低等优点,已经成为临床试验中使用率最高的一种病毒载体,占病毒载体的30.2%[26]。Dragoo等[27]首次报道了Ad介导的BMP-2基因转染人类ADSCs后,体外细胞外基质中有大量钙的沉积;在一项治疗大鼠顶骨缺损的实验中,其成骨效率也优于单独应用ADSCs[28]。

Lv具有无毒,不易诱发宿主免疫反应,所能插入的目的基因片段容量大,能感染分裂细胞、非分裂细胞和终末分化细胞(如神经细胞、肌纤维细胞、视网膜细胞和肝细胞等),也能够整合于宿主细胞基因组,理论上实现目的基因永久表达等优点[29],已成为当前基因传递载体研究的热点。Virk等[30]发现与Ad转导的BMP-2转移相比,Lv转导的BMP-2显示了更好的骨修复趋势。通过Lv产生BMP-2的BMSC在体外具有诱导长期蛋白质生成的能力,并在体内产生大量的新骨形成。Bougioukli等[31]首次报导了对BMSCs和ADSCs在Lv两步转录扩增系统(two-step transcriptional amplification system,TSTA)转染BMP-2(Lv-TSTA-BMP-2)成骨的研究,发现两者均可快速诱导成骨分化,但ADSCs效果更佳。与BMSCs相比,大多数培养的ADSCs共同表达正确的CD标记物,ADSCs产生的BMP-2几乎是BMSCs的3倍。此实验也证实了年龄与人体脂肪抽吸物组织的细胞产量之间没有关联,脂肪组织分离的细胞在所有传代中都具有更快的细胞生长和更高的细胞产量。也有学者将分别转染Lv-BMP-2和Lv-BMP-7的ADSCs单独或联合植入β-TCP支架上进行体外培养,然后将ADSCs/β-TCP构建物植入大鼠股骨缺损中6周。结果表明BMP-2和BMP-7基因共转染组在体内比BMP-2组和BMP-7组显著提高了新骨形成效率[32]。

壳聚糖作为一种非病毒基因载体,具有良好的生物相容性和生物可降解性,是一种安全、易于构建的高分子,可以保护DNA免受降解[33]。有学者评估了Lv与BMP-2/FGF-2双基因系统共转染的ADSCs的体外成骨特性,结果显示两种因子之间具有良好的协同作用,与单独转染其他因子相比具有更高的成骨指数[34]。

3 ACSDs与基因增强组织工程

基因增强组织工程是将两者相结合的新技术,选择合适的基因转移方式、理想的目标基因、优化种子细胞、制备高效的转移体系来进行骨修复。其优势为：转染的细胞可持续高效地表达特定功能因子以促进其自身及其他效应细胞的增殖与分化,从而能更好、更快地形成骨修复再生所需的组织;合成分泌的特定功能因子在缺损部位的浓度和活性更高,避免了外源性功能因子大剂量反复使用所带来的副作用;载体的稳定性好,半衰期长,持续时间足以满足缺损修复再生的需要[35]。有学者将TGF-β1和BMP-2加载到壳聚糖上,然后与海藻酸钠/透明质酸/胶原(Alg/HA/Col)结合构建颌骨支架,并对Alg/HA/Col颌骨支架的含水量、孔隙率、拉伸性能、生物相容性和成骨诱导分化能力进行了研究。发现该方法能够成功构建一种全新的三维多孔颌骨支架,其孔径为100～250 μm,孔隙率>90%,与正常骨组织极为接近,同时对ADSCs无细胞毒性,支架的ALP定量、OC表达量均上调,这种三位支架具有广泛的应用前景[36]。Vakhshori[37]将编码BMP-2的Lv转导ADSCs后植入TCP/HAP载体上来评估大鼠股骨缺损的疗效,实验发现转导Lv的BMP-2(约0.48 μg)诱导形成的骨质量与10 μg重组人BMP-2相当,在平均扭矩、扭转刚度和扭转致骨折的力度方面与正常骨比较差异无统计学意义。

4 总结与展望

ADSCs来源稳定丰富,具有良好的成骨效应,是骨再生领域最有前景的种子干细胞之一。随着基因载体的选择性逐渐增加、复合支架的物理及化学特性,材料之间的融合技术日趋成熟,ADSCs在体外以及动物实验中都取得了较大进展。但基因转染后细胞在体内的稳定性,以及ADSCs向成骨、成软骨分化的具体机制尚不明确,虽然偶有ADSCs应用于临床的治疗报导,但其安全性仍需进一步评估。