施用生物炭对连作三七根际真菌群落与存活率的影响

赵林艳 徐武美 王豪吉 王昆艳 魏富刚 杨绍周 官会林

（1.云南师范大学高原特色中药材种植土壤质量演变退化与修复云南省野外科学观测研究站，昆明 650500；2.云南省生态环境科学研究院，昆明 650034；3.文山苗乡三七科技有限公司，文山 663099）

三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］为五加科人参属植物，是我国名贵中药材，也是复方丹参片、云南白药、血塞通、片仔癀等中成药的重要原料［1］，具有活血化瘀、消肿定痛的功效，常用于治疗心脑血管疾病［2］。三七栽培周期一般需要3年以上，且在种植过程中大量使用化肥和农药，使三七种植土壤板结酸化、养分富集、微生物群落失衡、病原微生物增加与化感物质积累，导致连作障碍的发生［3］。连作三七发病率可达90%以上，严重影响三七产业的可持续发展［4］。

生物炭是农林废弃物在限氧环境下高温（250-700℃）热解产生的高度芳香化、富含碳的固态物质［5］。研究表明，生物炭作为土壤改良材料，可有效调节土壤pH、电导率，提高土壤养分含量、促进作物生长［6-7］。此外，生物炭可显著提高土壤微生物多样性，调节土壤微生物群落结构［8-9］。在连作障碍消减方面，周丽靖等［10］研究表明，向百合连作土中施加竹炭和稻壳炭提高了土壤有机质、碱解氮、有效磷和有效钾含量，降低了病原菌丰度，提高了百合产量和品质。杨莉等［11-12］研究表明，向人参连作土壤中施加生物炭提高了土壤养分含量与重茬人参生物量及总皂苷含量。Wu等［13］研究表明，向太子参连作土壤中施加生物炭干扰了病原尖孢镰刀菌（F.oxysporum）的正常代谢过程，抑制了其菌丝生长，进而降低了土壤中病原菌丰度与太子参发病率。此外，施用生物炭可显著提高白及连作土壤酶活性，调节土壤细菌群落结构，并促进白及的生长［14］。

真菌群落对土壤环境变化敏感，其生物量与多样性受土壤温度、水分、养分、植物群落等多种因素的影响，可间接反映土壤健康状况［15］。研究表明，随着三七连作年限的延长，真菌群落多样性降低，病原镰刀菌丰度增加，有益真菌丰度降低，是三七连作障碍的主要成因［16-17］。生物炭可有效消减百合［10］、人参［12］、太子参［13］和白及［14］等药用植物连作障碍问题，而针对名贵中药材三七连作障碍的田间试验研究，还鲜见报道，其内在作用机理亦不清楚。因此，本研究以10年三七连作地为试验对象，通过探索不同生物炭施加量对连作三七存活率、土壤理化性质、真菌群落与病原尖孢镰刀菌丰度的影响，揭示生物炭对三七连作障碍的消减效果与内在机理，为促进三七产业可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究于 2019年1月在云南文山三七科技示范园（23°31'44.48″N，104°19'13.65″E）进行，区域年平均气温约16.6℃，降水量约1 111 mm，土壤类型属酸性红壤，三七连作10年［18］，土壤pH 为6.01，电导率为201.33 μS/cm，有效氮含量为26.63 mg/kg，有效磷含量为18.21 mg/kg，有效钾含量为157.52 mg/kg。本研究中生物炭施加量为0、12与15 t/ha，标记为T0、T1与T2，每个处理重复4次，采用随机区组设计。每个田间试验小区面积为6.0 m2（1.5 m×4.0 m），生物炭与表层20 cm土壤充分混匀；此外，每个小区施加0.5 kg/m2有机肥作为底肥。施用生物炭和底肥两周后，于2019年1月移栽三七籽条，每个小区移栽200株，随后统一浇水，不再施加肥料。在移栽18个月后，统计三七存活率；采用五点法在每个小区随机采取5个三七根际土壤样品，去除石砾、松针后，混合均匀，一部分自然风干、研磨过0.15 mm筛，用于土壤理化性质的测定，另一部分保存于-80℃冰箱，用于真菌群落与病原尖孢镰刀菌的定量分析。本研究使用的生物炭是由稻壳在500℃环境下限氧热解2 h制备而成，经粉碎后过2 mm筛，用于田间试验，其pH为9.76，电导率为342.37 μS/cm，有效氮含量为37.56 mg/kg，有效磷含量为289.59 mg/kg，有效钾含量为711.93 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性质 土壤pH使用pH计（PHS-25）进行测定，水土比为2.5∶1；电导率使用EC计（COMBI 5000）进行测定，水土比为5∶1；土壤NH4+-N和NO3--N采用1 mol/L KCl浸提，有效钾（AK）用1 mol/L CH3COONH4浸提，使用连续流动分析仪（SEAL AA3，SEAL Analytical，德国）进行测定；土壤有效磷（AP）用0.5 mol/L NaHCO3浸提，用钼锑抗比色法进行测定；土壤有机质含量（OM）用重铬酸钾氧化法进行测定［14］。

1.2.2 土壤总DNA的提取和测序 使用BioFast试剂盒（BioFlux，中国）提取土壤样品总DNA，使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）扩增真菌ITS片段。PCR产物采用AMPure XP试剂盒（Beckman Coulter Life Sciences，美国）和QuantiFluorTM-ST荧光定量系统（Promega，美国）进行纯化和定量。使用Illumina HiSeq 2500系统进行高通量测序。

1.2.3 土壤中尖孢镰刀菌的定量检测 使用荧光定量PCR系统（Heal Force GC-05，中国）对土壤中尖孢镰刀菌的丰度进行测定。采用特异性引物ITS1 F（5'-CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和AFP 308 R（5'-CGAATTAACGCGAGTC CCAAC-3'）进行PCR扩增［19］。PCR 反应体系为：TSINGKE SYBR Green Master Mix 10 μL、引物混合液1.6 μL（正向和反向引物各 10 μmol/L）、模板DNA 1 μL，加去离子水至20 μL。PCR程序设置为：95℃保持2 min，加45个循环（95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s），每个循环在72℃时进行荧光检测；程序运行完成后，根据溶解曲线鉴定PCR产物特征峰；标准曲线R2=0.996，扩增效率为108%。

1.2.4 数据分析 将高通量测序获得的双端测序数据用FLASH V1.2.7和Trimmomatic软件进行拼接和过滤，使用UCHIME v4.2去除嵌合体，用UPARSE软件按97%的序列相似性划分OTUs（Operational Taxonomic Units）；使用RDP软件以真菌ITS UNITE数据库（https://unite.ut.ee/）为参照对不同OTU的代表性序列进行分类学注释，使用MOTHUR软件计算各样品真菌OTU丰度、ACE与Chao1多样性指数及系统发育多样性指数（phylogenetic diversity，PD）；以上分析均利用百迈克云平台（http://www.biocloud.net/）进行。

利用单因素方差分析与Duncan多重比较分析不同处理下三七存活率和土壤理化性质的差异显著性；基于Bray-Curtis距离指数在OTU水平进行冗余分析（RDA）；采用相关性分析探索土壤理化性质、微生物多样性与三七存活率之间的关联性。以上分析利用SPSS 16.0统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL）与R软件“vegan”包进行。

2 结果

2.1 施用生物炭对土壤理化性质的影响

施用生物炭对土壤理化性质具有显著影响（表1）。与T0相比，施用生物炭显著提高了土壤pH与NO3--N、AK含量，降低了NH4+-N含量（P＜0.05）；T1处理下土壤pH、NO3--N、AK含量分别提高了17.3%、40.8%、47.39%，NH4+-N含量降低了13.22%；T2处理下土壤pH、NO3--N、AK含量分别提高了6.5%、13.6%、40.3%，NH4+-N含量降低了21.2%。

2.2 生物炭对土壤真菌群落多样性的影响

三七种植18个月后，不同处理下各土壤样品高通量测序共获得908 609条真菌ITS序列，根据97.0%的相似度划分OTU，共得到OTU 782个，隶属于8门27纲73目131科209属288种。不同处理下均有分布的真菌OTU数占总OTU数的8.1%，T0、T1、T2特有OTU数分别占总OTU数的12.3%、12.4%、49.2%（图1-A）；利用稀疏标准化（rarefaction）的方法比较不同处理下真菌群落OTU丰富度（OTU richness），T2处理下真菌OTU丰富度显著高于T0和T1（P＜0.05，图1-B），且ACE、Chao1和PD多样性指数较高（P＜0.05）；此外，土壤pH与真菌群落多样性呈显著正相关（P＜0.05，图2）。

图1 不同生物炭施加量处理下三七根际土壤真菌OTU丰富度Fig.1 Fungal OTU richness in the rhizosphere soil of P.notoginseng under the treatments with different biochar application amounts

图2 不同生物炭施加量处理下三七根际土壤真菌α多样性指数及其与土壤pH的关联性Fig.2 α-diversity index of soil fungi in the rhizosphere of P.notoginseng and its correlation with soil pH under the treatments with different biochar application amounts

2.3 生物炭对土壤真菌群落组成的影响

在门分类水平上，子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为土壤中优势真菌类群，在T0中的占比分别为55.8%、9.8%和17.3%，在T1中的占比分别为59.3%、9.2%和10.9%，在T2中的占比分别为31.9%、45.5%和10.0%（图3）。在属分类水平上，被孢霉属（Mortierella）为土壤中的优势真菌类群，T2处理显著提高了被孢霉属的相对丰度，降低了镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度（图4-A、B）。土壤中病原尖孢镰刀菌定量分析结果表明，与T0相比，T1和T2处理显著降低了土壤中尖孢镰刀菌丰度（P＜0.05，图4-C）。Spearman相关分析表明，尖孢镰刀菌丰度与土壤pH、AK和真菌α多样性指数呈显著负相关，被孢霉属相对丰度与真菌α多样性指数呈显著正相关（P＜0.05，图5）。RDA分析表明，不同生物炭处理下土壤真菌群落具有明显的分化特征，土壤pH、NH4+-N含量是影响真菌群落结构的关键土壤因子（图6）。

图3 不同生物炭施加量处理下三七根际土壤真菌门分类水平的相对丰度Fig.3 Relative abundance of soil fungi at the phylum level in the rhizosphere of P.notoginseng under the treatments with different biochar application amounts

图4 不同生物炭施加量处理下被孢霉属与镰刀菌属相对丰度及尖孢镰刀菌丰度Fig.4 Relative abundances of Mortierella and Fusarium,and the abundances of F.oxysporum under the treatments with different biochar application amounts

图5 土壤理化因子与被孢霉属、镰刀菌属相对丰度及尖孢镰刀菌丰度之间的关联性Fig.5 Correlations between soil physicochemical properties and the relative abundances of Mortierella and Fusarium, and the abundances of F.oxysporum

图6 不同生物炭施加量处理下土壤真菌群落RDA分析结果Fig.6 Redundancy analysis of soil fungal community under the treatments with different biochar application amounts

2.4 生物炭对连作三七存活率的影响

施用生物炭对连作三七存活率具有显著影响（图7）。三七种植18个月后，T0、T1、T2处理下三七平均存活率分别为6.0%、16.0%和30.0%；与T0相比，T1和T2处理显著提高了三七存活率（P＜0.05，图7）。此外，三七存活率与土壤pH、真菌α多样性和被孢霉属相对丰度呈显著正相关，与土壤NH4+-N含量和尖孢镰刀菌丰度呈显著负相关（P＜0.05，图8）。

图7 不同生物炭施加量处理下三七存活率Fig.7 Survival rates of P.notoginseng under the treatments with different biochar application amounts

图8 土壤理化性质、真菌α多样性、被孢霉属相对丰度、尖孢镰刀菌丰度与三七存活率的关联性Fig.8 Correlations between soil physicochemical properties, fungal α diversity, relative abundance of Mortierella,F.oxysporum abundance, and the survival rate of P.notoginseng

3 讨论

3.1 施用生物炭影响三七连作土壤理化性质

在本研究中，施用生物炭显著提高了三七连作土壤pH、增加了NO3--N、AK含量（表1）。杨莉等［12］也研究发现，施用稻壳炭显著提高了人参连作土壤pH与碱解氮、有效钾含量。生物炭对土壤pH的提升效应，可能与其灰分含量、碱性阳离子和官能团特征相关，Li等［20］研究表明，高温制备的生物炭灰分含量与其pH呈显著正相关。此外，生物炭施入土壤后释放的Ca2+、Mg2+、K+等，可提高土壤pH，且生物炭表面携带的负电荷官能团（酚类、羧基和羟基）可结合土壤中的H+［21-22］。由于生物炭在热解炭化过程中有机质挥发，可溶性磷酸盐和钾盐含量大幅增加［23］。本研究使用的稻壳炭有效钾含量达711.93 mg/kg，其施用后可直接增加土壤有效钾含量。施用生物炭显著提高了土壤NO3--N含量，这可能与生物炭的吸附效应有关。刘玮晶等［24］研究表明，生物炭可提高土壤对NO3--N的吸附，减少淋溶，从而增加土壤中NO3--N含量。此外，生物炭可有效促进土壤硝化作用，促进NH4+向NO3-转化［25］，这可能是施炭导致土壤中NO3--N含量增加、NH4+-N含量减少的原因之一。

3.2 施用生物炭调节连作三七根际土壤真菌群落

本研究表明，三七种植18个月后，15 t/ha生物炭处理下其根际真菌α多样性显著升高。同样，Meng［26］和Tarin等［27］也发现施加生物炭可显著提高土壤真菌α多样性，可能是由于生物炭的高孔隙率为真菌生长提供了栖息地，有助于减少不同真菌的种间竞争，从而促进土壤中多种真菌共存［28-30］。本研究发现，施用生物炭显著提高了土壤pH，而土壤pH与真菌α多样性呈显著正相关；RDA分析结果也表明，15 t/ha生物炭处理后，土壤pH是影响真菌群落结构的主要因素。因此，施用生物炭可通过提高土壤pH，间接影响土壤真菌群落［31］。

在属分类水平上，被孢霉属为三七根际土壤优势菌群，且施用生物炭显著提高了土壤中被孢霉属的相对丰度。Miao等［17］研究发现，在健康三七根际土壤中，被孢霉属为优势真菌类群，其相对丰度可达44.9%。Arafat等［32］研究发现，随着茶树种植时间的增加，一些有益的被孢霉属菌种（如Mortierella alpine与M.elongatula）相对丰度随之减少；Shen等［33］研究认为，被孢霉属是潜在的生防菌，与降低香蕉枯萎病发病率存在显著关联性。此外，Wang等［34］发现施用生物炭显著增加了土壤中被孢霉属的相对丰度，促进了水稻生长。因此，施用生物炭提高土壤中被孢霉属的相对丰度，可能有利于连作三七的生长。

镰刀菌属中许多菌种会引起植物病害［35-36］，其中尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和腐皮镰刀菌（F.solani）均可引起三七根腐病［37］。在本研究中，施用生物炭显著降低了土壤镰刀菌属相对丰度，且尖孢镰刀菌丰度随生物炭施加量的增加而显著降低，这与Ren等［38］的研究结果一致。本研究还发现，土壤pH与尖孢镰刀菌丰度呈显著负相关，因此施用生物炭提高三七连作土壤pH，可能是其降低病原尖孢镰刀菌丰度的重要原因。Li等［39］亦研究发现，生物炭可通过提高土壤pH抑制腐皮镰刀菌孢子萌发，并影响菌丝生长。本研究表明，施用生物炭降低了土壤中铵态氮的积累，Liu等［40］研究表明，土壤NH4+-N含量可显著影响植物根际土壤微生物群落，且常与病原菌丰度呈正相关。

3.3 施用生物炭提高连作三七存活率

本研究表明，施用生物炭有效提高了连作三七存活率，且其与土壤NH4+-N含量和尖孢镰刀菌丰度呈显著负相关，与pH、真菌α多样性和被孢霉属相对丰度呈显著正相关。Ou等［41］研究表明，土壤中NH4+积累可胁迫三七生长，抑制三七抗病性，是导致三七减产的重要原因。此外，有研究表明，生物炭通过调节土壤pH、提高土壤养分有效性与微生物多样性、降低病原微生物丰度，从而促进作物生长，提高作物产量，消减连作障碍问题［42-44］。如Liu等［45］研究发现，施用生物炭通过提高人参连作土壤肥力、增加真菌和细菌多样性、降低镰刀菌属相对丰度，从而消减人参连作障碍。Tian等［46］研究发现，施用生物炭可有效改善土壤微生物群落结构，防治重茬西洋参根腐病。因此，施炭导致的三七连作土壤pH升高，铵态氮含量降低，被孢霉属等有益真菌增加，病原尖孢镰刀菌丰度降低，可能是其提高连作三七存活率、消减三七连作障碍的主要原因。

4 结论

施用生物炭通过提高三七连作土壤pH、被孢霉属相对丰度及真菌多样性，降低土壤铵态氮含量与病原尖孢镰刀菌丰度，显著提高了三七存活率，是消减三七连作障碍的有效措施。本研究为促进三七种植业可持续发展提供了科学依据，也为其他药用植物连作障碍消减提供参考。