褪黑素种子引发处理提高朝天椒耐盐性的作用机制

魏茜雅 秦中维 梁腊梅 林欣琪 李映志

（广东海洋大学滨海农学院，湛江 524088）

土壤盐渍化是限制作物生长及产量的重要逆境胁迫之一，全世界约20%的耕地和33%的灌溉农田受到盐胁迫的影响，预计到2050年，50%以上的耕地面积将出现盐碱化，严重制约着农业的发展［1-2］。盐渍对植物的伤害主要表现在破坏细胞膜系统，使细胞内离子失去平衡，从而影响植物的生长和发育［3］。研究表明，盐胁迫能通过阻碍棉花的养分吸收抑制植株生长［4］，盐害会严重破坏辣椒幼苗的生理特性［5］，盐胁迫会降低辣椒叶片净光合速率，抑制植株生物量的积累［6］。

种子质量和活力对幼苗的生长和产量的增加起着重要作用，是培育高质量蔬菜的基础［7］。种子引发技术可以通过修复细胞膜的损伤，提高种子活力和耐脱水力，提高植株生理生化特性来抵御逆境胁迫［8］。研究表明，引发处理后的种子比未引发的种子在发芽和生长过程更有优势［9］；Gao 等［10］认为通过引发提高种子活力，可以增强植株生长过程中的耐逆性；种子引发技术可以通过刺激发芽过程中的新陈代谢，提高各个生长阶段的抗氧化系统来抵御盐害带来的压力［11］。

辣椒（Capsicum annuum）起源于中南美洲，16世纪前后传入中国，是一种非常古老的栽培植物［12］。辣椒育种目前已由单一目标向多目标育种发展，不仅要求选育品种高产，还要抗多种胁迫［13］。种子引发（seed priming）处理可以促进萌发代谢，从而加速萌发和出苗，并保持较高的出苗一致性，还可以增强种子在胁迫条件下的萌发力［14］。褪黑素（melatonin, MT）是一种天然无毒分子，可作为强有效的内源性抗氧化剂存在于植物体内，其在清除植物体内过量的活性氧、生殖发育、营养吸收和果实成熟等方面具有重要的作用［15-16］。褪黑素最初发现于维管植物中，具有多功能性，可通过影响多种代谢途径来调节或增强植物抗逆性，缓解重金属胁迫、干旱胁迫、低温或高温逆境对高等植物的损害［17］。Posmyk等［18］通过对红球甘蓝（Brassica oleracea）的研究发现，褪黑素引发能够消除离子的抑制作用，提高红球甘蓝种子的发芽率。董秋丽等［19］发现，褪黑素能提高干旱胁迫下达乌里胡枝子种子的活力水平。Kołodziejczyk等［20］发现，褪黑素引发玉米种子可显著提高玉米抵御低温胁迫的能力。

褪黑素在提高作物耐盐性方面发挥着重要作用，但关于褪黑素引发种子对盐胁迫下辣椒幼苗生长及生理生化代谢的调控鲜有报道。本实验以‘茂蔬360’为材料，采用不同浓度的褪黑素溶液引发辣椒种子，探究盐胁迫下辣椒幼苗生长、光合特性、抗氧化能力、渗透调节物质含量和叶、茎、根中K+及Na+含量的变化，以期为减轻盐胁迫对辣椒生长的抑制作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验于2022年5月在广东海洋大学林果楼培养室和南亚热带作物研究所避雨棚内进行。供试朝天椒品种为‘茂蔬360’，褪黑素购自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 挑选籽粒饱满的朝天椒种子置于烧杯中，倒入10 mL 浓度为 0（T0）、1（T1）、5（T5）、25（T25）、50（T50）、75（T75）、100（T100）、125（T125）、150（T150）和200（T200）μmol/L的褪黑素溶液避光浸泡12 h，捞出冲洗2-3遍，于25℃的暗室中自然风干至原始含水量。每个处理各60粒，分3次重复。

经褪黑素溶液引发种子后，盐胁迫下朝天椒根长和地上高度明显增加，与未引发（CK）相比，100 μmol/L 褪黑素溶液引发处理显著（P＜0.05）提高了植株根长和地上高度，分别增加69.36%和56.48%；50 μmol/L褪黑素引发处理的根/冠最大，比未引发增加16.18%，差异显著（P＜0.05）（图1）。

经不同浓度褪黑素溶液引发种子后，盐胁迫下朝天椒植株的鲜重、叶片鲜重、茎鲜重和根鲜重都有所提高，与未引发（CK）相比，100 μmol/L褪黑素溶液引发处理最大程度促进了植株鲜重、叶片鲜重和根鲜重，分别增加85.95%、98.23%和48.61%；75 μmol/L的茎鲜重最大，比未引发增加了127.51%，差异显著（P＜0.05）（图2）。

1.2.3 叶绿素含量和叶绿素荧光特性分析 叶绿素含量使用SPAD叶绿素仪进行测定，每个处理选择3株，选取每个叶片叶脉两侧3个位置取平均值。叶绿素荧光参数的测定：将朝天椒植株暗适应30 min后，使用叶绿素荧光仪（FluorPen）测定，每个处理重复3次，选取每个叶片叶脉两侧进行测定。

1.2.4 指标测定 可溶性糖（soluble sugar, SS）含量的测定采用蒽酮比色法［22］；丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法［23］；抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）活性采用Yoshiyμki法测定［24］；可溶性蛋白（soluble protein, SP）含量采用考马斯亮蓝G-520法测定［23］；过氧化物酶（peroxidase, POD）、脯氨酸（proline,Pro）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）活性和超氧阴离子（superoxide anion,O-）用试剂盒（索莱宝）测定；抗坏血酸（ascor-2bic acid, AsA）和脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate,DHA）活性测定采用分光光度法［25］。

2.4.5 不同浓度褪黑素种子引发处理对朝天椒叶片AsA、DHA和AsA/DHA含量的影响 经100 μmol/L褪黑素溶液引发处理，叶片AsA和DHA含量最大，比未引发增加155.23%、61.85%；浓度为125 μmol/L时，叶片AsA/DHA含量最大，比未引发增加90.03%，差异显著（P＜0.05）（图9）。

1.2.5 数据处理 采用 Microsoft Excel 2019 软件和SPSS 24.0软件进行统计分析和绘图，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验，P＜0.05表示存在显著性差异。

播种后，分别记载各品种的出苗期，并在出苗后观察统计各生长阶段的生长势、病虫害发生情况和倒伏情况；在大麦成熟后，每小区随机抽选10株进行考种，测量并记载其株高、穗长、小穗数、穗粒数等性状，同时将每个小区分开，单收、单脱、单计产，并折算产量。试验数据采用Excel2003和SPSS统计软件进行分析处理。

2 结果

2.1 褪黑素种子引发处理对盐胁迫下朝天椒根长、地上高度和根冠比的影响

取引发和未引发（CK）的种子置于垫有3层滤纸的培养皿中，在人工气候培养箱中催芽（人工气候培养箱，温度25℃，光照周期为12 h光照/12 h黑暗，光照强度7 600 lx，相对湿度60%）。种子萌动后，将其播至上直径12.0 cm、下直径7.5 cm、高5.5 cm的育苗盆中，栽培基质为椰糠基质，每株一盆，转移到避雨棚内生长。4-6叶期时进行盐胁迫处理，每盆浇灌50 mL 100 mmol/L NaCl溶液，每2 d浇灌1次。盐胁迫处理14 d后，取样分析。每处理重复3次。

Egger′s检验(t=0.39，P=0.708)、Begg′s检验(Z=-0.27，P=0.784)和漏斗图(图5)的结果均提示，本篇Meta分析不存在发表偏倚。

图1 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒根长（A）、地上高度（B）和根冠比（C）的影响Fig.1 Effects of seed priming with melatonin（MT）at different concentration on the root length（A）,above ground height（B）and root shoot ratio（C）of C.annuum under salt stress

2.2 褪黑素种子引发处理对盐胁迫下朝天椒各组织鲜重和干重的影响

1.2.2 形态特征分析 盐胁迫处理14 d后将朝天椒植株的根系用去离子水清洗干净后吸干表面水分，用电子天平称其叶片、茎和根系鲜重，毫米尺测定株高和根长［21-22］。置于105℃烘箱中杀青15 min，80℃下干燥至恒重后，测定植株叶片、茎和根系干重。每个处理重复3次。

2.4.1 不同浓度褪黑素种子引发处理对盐胁迫下朝天椒叶片丙二醛和ROS含量的影响 经褪黑素溶液引发种子后，盐胁迫下朝天椒叶片的丙二醛和ROS含量随着引发液浓度的增加呈现先降低后上升的趋势，100 μmol/L 褪黑素溶液引发处理时，叶片丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子含量最小，比未引发降低63.42%、42.63%、20.94%，差异显著（P＜0.05）（图5）。

图2 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒鲜重（A）、叶片鲜重（B）、茎鲜重（C）和根鲜重（D）的影响Fig.2 Effects of melatonin at different concentration on the plant fresh weight（A）, leaf fresh weight（B）, stem fresh weight（C）and root fresh weight（D）of C.annuum under salt stress

经褪黑素溶液引发种子后，盐胁迫下朝天椒植株的干重、叶片干重、茎干重和根干重与未引发（CK）相比，75 μmol/L褪黑素溶液引发处理最大程度促进了植株干重、叶片干重和茎干重，分别增加129.29%、136.70%和171.45%；100 μmol/L褪黑素引发处理的根干重最大，比未引发增加85.73%，差异显著（P＜0.05）（图3）。

图3 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒干重（A）、叶片干重（B）、茎干重（C）和根干重（D）的影响Fig.3 Effects of melatonin at different concentration on the plant dry weight（A）, leaf dry weight（B）, stem dry weight（C）and root dry weight（D）of C.annuum under salt stress

2.3 褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒叶片叶绿素含量和叶绿素荧光特性的影响

2.4.2 不同浓度褪黑素种子引发处理对盐胁迫下朝天椒叶片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响 经褪黑素溶液引发种子后，盐胁迫下朝天椒叶片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量随着引发液浓度的增加呈先上升后下降的趋势，100 μmol/L褪黑素溶液引发处理时，叶片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量最大，比未引发增加172.75%、340.40%、256.77%，差异显著（P＜0.05）（图6）。

图4 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒叶片叶绿素荧光参数Fv'/Fm'（A）、Qp（B）、NPQ（C）、Fo（D）、Fv/F0（E）、Fv/Fm（F）和SPAD值（G）影响Fig.4 Chlorophyll fluorescence parameter Fv'/Fm'（A）, Qp（B）, NPQ（C）, Fo（D）, Fv/F0（E）, Fv/Fm（F）and SPAD value（G）in the leaves of C.annuum affected by melatonin at different concentration

2.4 不同浓度褪黑素种子引发处理对盐胁迫下朝天椒叶片生理特性的影响

1) 在DPST模式中：当原油需长距离运输时，例如从巴西到中国，会选择一个中转点(油库或锚地)倒油，将原油从DPST转到常规油船上，由常规油船运输到目的地；当原油只是短距离运输时，例如从巴西到美国，没有转驳倒油的过程，由DPST直接将原油输送至目的地(见图2)。

There was a lack of surgery standardization (there were no clear criteria for splenectomy or spleen-saving dissection of the 10th LN group, instrumental or manual anastomosis, etc.).

另外，对于学生们在实验中出现实验失败、而又无法重新实验的情况,可在计算机模拟生理实验中进行操作,重复观察实验结果,弥补实验失败造成无法观察实验现象的不足.另外,对于一些由于课时限制而不能开设的生理学实验,比如影响家兔动脉血压因素的实验,就可以让学生在模拟实验中体会各种因素对心脏收缩活动的影响,进一步拓宽学生们的学习范围.

图5 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒叶片MDA（A）、过氧化氢（B）和超氧阴离子含量（C）的影响Fig.5 Effects of melatonin at different concentration on the contents of MDA（A）, hydrogen peroxide（B）and superoxide anion（C）in the leaves of C.annuum under salt stress

当褪黑素浓度为100 μmol/L时，FV'/Fm'、Qp、NPQ、Fo、FV/Fm和叶绿素值最大，与未引发相比，分别增加11.15%、10.81%、42.53%、23.90%、1.71%和50.74%，差异显著（P＜0.05）；75 μmol/L褪黑素引发处理的FV/F0最大，此时与未引发相比，增加了8.01%，差异不显著（图4）。

图6 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒叶片可溶性糖（A）、可溶性蛋白（B）和脯氨酸含量（C）的影响Fig.6 Effects of melatonin at different concentrations on the contents of soluble sugar（A）, soluble protein（B）and proline（C）in the leaves of C.annuum under salt stress

2.4.3 不同浓度褪黑素种子引发处理对朝天椒叶片POD、CAT和SOD活性的影响 经褪黑素溶液引发种子后，盐胁迫下朝天椒叶片的POD和SOD活性随着引发液浓度的增加呈抛物线变化趋势，100 μmol/L褪黑素溶液引发处理，叶片POD和SOD活性最大，比未引发增加142.22%、277.20%；浓度为125 μmol/L时，叶片CAT活性最大，比未引发增加142.91%，差异显著（P＜0.05）（图7）。

图7 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒叶片POD（A）、CAT（B）和SOD（C）活性的影响Fig.7 Effects of melatonin at different concentrations on the POD（A）, CAT（B）and SOD（C）activities in the leaves of C.annuum under salt stress

2.4.4 不同浓度褪黑素种子引发处理对盐胁迫下朝天椒叶片APX和GR活性的影响 经褪黑素溶液引发种子后，盐胁迫下朝天椒叶片的APX和GR活性随着引发液浓度的增加呈抛物线变化趋势，100 μmol/L 褪黑素溶液引发处理，叶片APX和GR活性最大，比未引发增加212.15%、109.13%，差异显著（P＜0.05）（图8）。

图8 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒叶片APX（A）和GR（B）活性的影响Fig.8 Effects of melatonin at different concentration on the APX（A）and GR（B）activities in the leaves of C.annuum under salt stress

“大麦屿港区重点发展现代物流业和对台直航运输。海门港区以服务台州主城区生产、生活物资运输为主。”周祥寿说，而作为台州的核心港区，头门港区近期以承接海门港区货运功能转移和临港工业发展为主，远期发展为集散功能强、临港工业发达的综合性港区，“清洁能源、汽车交易中心以及钢材交易中心等临港产业，将成为头门港区的远期潜力。”

图9 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒叶片AsA（A）、DHA（B）和AsA/DHA含量（C）的影响Fig.9 Effects of melatonin different concentrations on the AsA（A）, DHA（B）and AsA/DHA contents（C）in the leaves of C.annuum under salt stress

2.5 不同浓度褪黑素种子引发处理对盐胁迫下朝天椒植株各器官Na+、K+、Na+/K+离子含量变化的影响

经不同浓度的褪黑素溶液引发种子后，朝天椒植株中根、茎、叶各器官中K+积累量存在显著差异，主要表现为叶＞茎＞根；Na+积累量差异不显著；K+/Na+差异显著，表现为根＞茎＞根。叶、茎、根中K+积累量都在100 μmol/L时值最大，与未引发相比，分别提高了48.45%、58.92%和209.44%，差异显著（P＜0.05）；Na+积累量都在100 μmol/L时值最小，与未引发相比，分别降低了22.66%、33.36%和11.29%，差异显著（P＜0.05）； Na+/ K+在100 μmol/L时值最小，与未引发相比，分别降低了48.21%、57.99%和69.34%，差异显著（P＜0.05）（图10）。

图10 不同浓度褪黑素引发对盐胁迫下朝天椒叶、茎和根系的Na+（A）、K+（B）和Na +/K+（C）含量和比例的影响Fig.10 Melatonin at different concentrations affecting the contents and proportions of Na+（A）, K+（B）and Na+/K+（C）in the leaves, stems and roots of C.annuum under salt stress

3 讨论

3.1 褪黑素种子引发处理有助于盐胁迫下朝天椒植株生物量的积累

盐胁迫能通过破坏植株内部生理导致系统失调，产生离子毒害抑制农作物正常生长［26］。褪黑素参与调节植物生物量积累和应对多种环境压力［27］。有研究表明，褪黑素引发棉花种子可以显著提高植株的耐盐性［28］；褪黑素种子引发可以打破干旱胁迫对红花生长的抑制作用，保持植株生长的稳定性［29］。褪黑激素可以有效改善干旱对生物量积累和光合作用的抑制，从而增强幼苗对干旱的适应性［30］；褪黑素浸种可以改善盐分胁迫下玉米幼苗营养摄取和物质积累的能力［31］。本研究中，75 μmol/L和100 μmol/L褪黑素可以有效缓解盐胁迫对朝天椒植株生长的压力，50 μmol/L褪黑素能显著促进盐胁迫下根系的发育。

将新鲜荷叶置于恒温干燥箱中，60 ℃烘干至含水量8%以下，粉碎后过50目筛，密封于干燥自封袋中，置于干燥避光环境中保存。

3.2 褪黑素种子引发处理有效调节盐胁迫下朝天椒叶片SPAD值及光合系统

叶绿素含量是衡量植物耐盐性的重要指标之一，叶绿素的丧失通常伴随着光化学反应的失活，尤其是由PSII介导的光化学反应［32］。叶绿素荧光是研究植物光合作用的有效探针，可以有效地监测植物对逆境的光化学反应机理，从而可以更全面地评价植物的光合作用过程［33］。有研究表明，褪黑素能有效缓解叶绿素的下降速率、抑制叶绿素解体并提高PSII反应中心活性［34］；褪黑素能逆转热胁迫降低PSII的实际效率（ΦPSII）、电子传递率（ETR）和光化学猝灭系数（qP），并提高植物的胁迫能力［33］。褪黑素引发可以提高低温弱光胁迫下辣椒叶绿素含量和光合能力，并通过改善光合特性来缓解胁迫［35］。本研究表明，100 μmol/L褪黑素引发种子有效提高了盐胁迫下辣椒幼苗叶绿素含量，可能与褪黑素有抑制叶绿素降解的作用有关［34］；100 μmol/L褪黑素引发种子时，叶片叶绿素荧光参数PSII光化学活性（FV'/Fm'）、光化学淬灭系数（Qp）、非光化学荧光淬灭系数（NPQ）、初始荧光产量（Fo）和原初光能转化效率（FV/Fm）显著提高，说明褪黑素种子引发处理能有效提高植物对光能的利用效率，降低盐胁迫对朝天椒叶片PSII反应中心的破坏。褪黑素引发后各处理PSII潜在活性（FV/F0）与未引发相比不显著的原因，可能是朝天椒叶片PSII活性对褪黑素并不敏感，褪黑素种子引发处理只是缓解了盐胁迫造成的光系统Ⅱ（PSII）损伤。

3.3 褪黑素种子引发处理调控盐胁迫下朝天椒叶片的生理指标

盐胁迫下，黄瓜体内由非酶和酶抗氧化剂组成的活性氧清除系统可清除体内过多的活性氧［36］。有研究表明，褪黑素引发红花种子后，可以提高红花植株在干旱胁迫中的稳定性并激活抗氧化代谢系统，保护膜结构不受活性氧的损伤，从而提高植株的抗旱性［29］。100 μmol/L 褪黑素溶液进行水稻种子引发，显著减轻了Cu胁迫对水稻种子的不利影响，褪黑素浸种改善了水稻种子的抗氧化系统，从而减少了铜胁迫诱导的氧化产物的积累［37］。褪黑素引发可以减少黑麦草植株长期胁迫下ROS的积累，并增加抗氧化系统和非抗氧化系统的循环［38］。本研究中，100 μmol/L褪黑素引发种子可以使辣椒植株抗氧化代谢系统增强，最大限度地减少植株中ROS的积累，并保持细胞膜的完整性。

3.4 褪黑素种子引发处理调控盐胁迫下朝天椒各器官离子含量

氯化钠（NaCl）引起的盐度是离子毒性产生的主要原因［39］。Na+是造成植物盐害的主要离子，会对K+表现出明显的竞争性抑制作用，影响植物对K+的吸收，导致植物遭受Na+富集毒害与K+亏缺伤害［40］。本研究表明，盐胁迫处理下，随着褪黑素溶液浓度的增加，朝天椒植株各器官中K+表现为叶＞茎＞根，说明植株根部到茎部到叶部的离子选择性运输能力在褪黑素的作用下逐渐增强。朝天椒植株各器官中Na+积累差异不显著，说明朝天椒根、茎和叶拒Na+的能力一致，可以保护植株过量吸收Na+。维持植株体内较低的Na+/K+值，是植物适应盐分胁迫的重要方式之一［40］，朝天椒植株各器官中Na+/K+表现为根＞茎＞叶，且根部Na+/K+比例下降的更剧烈，说明褪黑素种子引发处理对朝天椒根系的影响更大，且植株各组织通过调节Na+/K+来抵抗盐胁迫［3］。Sezer等［30］研究也表明褪黑素可以通过调节玉米叶片Na+/K+来抵抗盐胁迫，Yan等［15］也发现褪黑素可以提高水稻根系Na+外排和K+涌入，缓解盐分对植株的损伤。

4 结论

通过不同浓度的褪黑素引发种子能有效缓解盐胁迫对辣椒幼苗生长的伤害，以100 μmol/L褪黑素引发时效果最好。褪黑素引发种子能显著改善辣椒植株光合荧光特性，降低丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子含量, 提高抗氧化酶活性和渗透调节物质含量, 提高叶、茎、根中K+含量，降低Na+含量和Na+/ K+，从而提高朝天椒的生长率并抵御土壤盐碱化对植株造成的损伤，促进盐胁迫下辣椒植株生长。