Cytochrome C在大鼠SAH后早期脑损伤的表达及意义

杨煌强 魏俊怀 江志贤

福建医科大学附属泉州市第一医院神经外科,福建省泉州市 362100

在脑血管意外中,蛛网膜下腔出血(SAH)是一种具有高死亡率和高致残率的疾病,并且,它的永久性残疾率和死亡率是缺血性脑卒中患者的2倍[1]。这些死亡的患者大多数是由于最初的出血和出血后早期脑损伤没有得到有效的治疗,研究认为这是造成那些幸存者高致死率和高致残率的主要原因。尽管过去几十年脑血管痉挛已经被许多药物研究和治疗,但即使脑血管痉挛被逆转,但患者的预后并没有得到明显改善[2-3]。基于这些原因, 早期脑损伤(EBI)被认为是未来研究的主要目标,也是防治SAH后脑血管痉挛症状的主要手段。EBI的病理分子机制包含血脑屏障通透性的改变、神经元和内皮细胞的凋亡及脑肿胀等。这些病理机制对SAH后神经功能的恢复具有重要影响[4]。

SAH后EBI的病理生理改变过程是由多条信号传导途径参与的。其中,起关键作用的信号通路将成为未来针对SAH后EBI治疗的研究热点,由于细胞凋亡现象在SAH后的脑组织被广泛发现,故细胞凋亡信号通路被认为是EBI的关键通路[5]。近年来研究认为JNK参与的Caspase的信号通路在细胞凋亡中起着主导作用,Cytochrome C是JNK磷酸化后作用的底物之一。所以,我们将Cytochrome C作为细胞凋亡途径的分子标志物,假设Cytochrome C参与SAH后早期脑损伤的病理生理过程[6]。因此,通过研究Cytochrome C在早期脑损伤的作用进一步证实抗细胞凋亡治疗对改善SAH后EBI是一种可行的治疗方法。

1 实验方法

1.1 动物分组 将成年的健康SD大鼠120只(体重300～350g,雄性),随机分成6组:(1)正常组(n=20),不予任何操作,自由生存,正常饲养;(2)假手术组(n=20),除未注入自体血外,其余步骤均按大鼠枕大池注血法[7]严格规范操作进行;(3)SAH组(n=20),大鼠SAH的动物模型是采用枕大池注血法建立的;(4)SAH+DMSO组(n=20),按10mg/kg的剂量标准,采用腹腔内注射法于蛛网膜下腔出血动物模型建立前1h和蛛网膜下腔出血模型建立后6h进行腹腔注射;(5)SAH+SP600125(10mg/kg)组(n=20),SP600125按10mg/kg溶解于DMSO溶液当中,分别在SAH模型建立前1h和模型建立后6h进行腹腔注射;(6)SAH+SP600125(30mg/kg)组(n=20),SP600125按30mg/kg相同的方法溶解于DMSO溶液中,在相同的时间点腹腔注射入实验动物。其中每组取6只用于TUNEL检测各组大鼠脑皮层细胞凋亡的情况;每组再取6只用于Western蛋白印迹法检测脑组织Cytochrome C表达情况。

1.2 各组大鼠生存情况的观察 各组大鼠的存活数目及神经功能行为:观察各实验组模型建立后24h大鼠的存活数目,依据Yamaguchi评分系统[8],分别从观察对象的进食量、活动力和功能缺损三个方面进行评分,本实验是在 SAH后24h对存活大鼠进行神经功能评分,评分越高,表明实验动物的神经功能损伤越重。具体评分标准见表1。

表1 Yamaguchi神经行为功能缺损评分标准

1.3 实验标本制备 实验标本的制备方法采取的是“心脏灌注固定法”在实验后24h分别将各分组动物处死并取材。具体步骤如下:使用10%的水合氯醛(0.3ml/kg)再次对大鼠进行腹腔内注射麻醉,然后,将麻醉后的大鼠取仰卧位固定于洁净手术台上,用手术剪暴露大鼠胸腔,于心尖处使用医用输液器针头刺入左心室,然后用显微剪刀打开大鼠右心房。通过左心室输注250ml磷酸盐缓冲液及250ml 0.9%氯化钠后,断头取脑组织备用。每组各随机选取12只大鼠完整大脑,用于TUNEL法及Western蛋白印迹法检测脑皮层组织凋亡征象。

1.4 蛛网膜下腔出血严重程度分析 蛛网膜下腔出血严重程度的评估已经有其他学者报道。简而言之,基底池被划分成6个区域:左右额部,左右颞部以及上下脑干。每一部位都评0～3分,每只大鼠评分0～18分。0分:蛛网膜下腔无血分布;1分:少量血液分布于蛛网膜下腔;2分:中等量血块;3分:大量血凝块。本实验中,在24h内处死的大鼠中如果出现硬膜下、硬膜外血肿或者少量下腔出血(评分<12分)的将被排除出实验。只有严重的下腔出血(评分>12分)的大鼠才被纳入实验组,进行进一步研究。每组各取6只大鼠的颞叶脑组织进行Western blot检测。剩下的每组大鼠经上述同样方法处理后;再次用4%多聚甲醛250ml灌注后取脑,并用4%多聚甲醛浸泡脑组织固定做TUNEL检测。

1.5 TUNEL染色法检测凋亡神经细胞 取下的大鼠脑组织标本于4%多聚甲醛中固定,然后将脑组织用石蜡包埋,行连续切片,每片厚度5μm,裱片后放入60℃烘箱烤片2h。采用TUNEL法(试剂盒购于美国罗氏公司)检测脑皮层组织中凋亡神经细胞。计算TUNEL阳性反应细胞数:每只大鼠在模型建立后24h、48h随机选取3张切片,在光学显微镜下观察皮层区 TUNEL阳性反应细胞数,随机选取2个视野在200倍镜下对阳性细胞进行计数并记录,并进行统计学分析。

1.6 Western Blot法检测Cytochrome C的表达情况 建立大鼠SAH模型后24h时,再次对其进行腹腔内注射麻醉,麻醉满意后进行开颅,迅速于穿刺侧出血块附近取大小1mm×1mm×1mm大脑皮质组织块(颈内动脉走行区域),冻存于-80℃冷冻箱中以备用。Cytochrome C表达蛋白的提取:(1)取冻存的脑组织标本100mg,将取到的标本剪碎,同时放入4℃冰水浴中,用超声将其粉碎,离心机离心20min,转速设定11 000r/min;留取离心的上清液,室温下放置30min备用。(2)采用酚试剂法测定蛋白的浓度。(3)蛋白变性。(4)配胶。(5)电泳。(6)转印。(7)封闭。(8)孵育一抗。(9)孵育二抗。(10)清洗。(11)显色。(12)Western Blot结果量化分析。利用Image-Pro Plus凝胶成像分析软件进行分析,对实验每条蛋白电泳带的灰度值记录,定量分析数据并统计图像。

1.7 统计学方法 利用SPSS20.0统计软件处理实验数据,以平均值±标准并表示实验结果;利用单因素ANOVA检验对各组均数之间进行比较, 以P<0.05表示组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察各实验组大鼠死亡率及神经功能缺损评分结果 在实验后24h对各组大鼠参照Yamaguchi评分系统进行死亡数及神经功能评分(见表1)。其中在假手术组和正常组均未见到大鼠死亡,且功能缺损未见明显异常,两组评分均为0分。SAH组中,大鼠的神经功能缺损评分3分和4分共有10只,死亡数7只,死亡率为35%, SAH+DMSO组经行为功能缺损评分主要分布在3分和4分,死亡数8只,死亡率40%。SAH+SP600125(10mg/kg)组及SAH+SP600125(30mg/kg)组这两个实验组在神经功能缺损评分主要分布在1分和2分,死亡数分别是3只和2只,死亡率分别15%和10%;这暗示NK抑制剂(SP600125)在改善SAH后小鼠的神经功能障碍症状有明显的效果(见表2)。

表2 各组大鼠24h神经行为功能缺损评分及死亡率

2.2 TUNEL检测凋亡神经细胞结果 本实验通过TUNEL法染色显示,各实验组均可见脑皮层凋亡细胞着色清晰,呈棕黄色,并且在大鼠SAH模型建立后的各个时间节点,呈棕黄色染色的凋亡细胞均明显多于假手术组。见表3、图1。

图1 各组大鼠不同时间点脑皮层细胞凋亡现象(TUNEL 染色;×200)

表3 细胞凋亡检测结果

2.3 Cytochrome C的表达结果 图2为Western印迹检测脑组织中Cytochrome C的变化。在本实验研究中,由图3可知在SAH后24h内,Cytochrome C的表达呈上升趋势;正常对照组内皮细胞中可表达微量的Cytochrome C,而且在各个时间点之间所获得灰度变化不明显;但是经JNK抑制剂(SP600125)干预后大鼠脑组织Cytochrome C的扫描条带灰度逐渐减弱,增加SP600125浓度随干预时间延长,Cytochrome C的灰度减弱得越明显。

图2 West-blot检测Cytochrome C的表达情况

图3 Cytochrome C表达情况比较

3 讨论

蛛网膜下腔出血是脑卒中最为致命的一类;虽然它仅仅占脑卒中5%,但是因为其在中老年中高致病性、高死亡率以及高致残率给社会、经济带来巨大负担。在动脉瘤破裂72h内造成的早期脑损伤被认为是治疗蛛网膜下腔出血的主要目标;神经细胞凋亡被认为是导致蛛网膜下腔出血后早期脑损伤主要原因[9]。本实验建立的标准大鼠SAH动物模型是运用枕大池注血法,该方法具有成功率高及操作简单等优点;通过观察建立大鼠SAH模型后24h的神经功能评分进一步证实了早期脑损伤存在于蛛网膜下腔出血。同时,我们运用TUNEL法检测发现实验动物的大脑皮层凋亡细胞计数增多,Cytochrome C表达上升。SP600125干预后实验动物神经功能缺损改善,大脑皮层和海马区凋亡细胞计数增多,Cytochrome C表达上升。据目前研究认为,SAH后产生的血液裂解产物的毒性作用、缺血性脑损伤、急性高颅压、再灌注损伤和急性脑血管痉挛等可能是造成早期细胞凋亡现象的主要原因。细胞凋亡的过程受多种复杂途径的调控,但JNK参与的Caspase信号通路在细胞凋亡起主导作用已被证实。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成员之一[10]。以往关于JNK在SAH后EBI发生发展中作用的研究表明:JNK信号传导通路参与EBI中凋亡机制的调节,其抑制剂SP600125是一种强效的ATP竞争性抑制剂,具有可逆性、选择性及细胞渗透性,在神经元细胞及血管内皮细胞凋亡过程发挥抑制性作用,进而能减轻SAH后早期损伤所造成的脑水肿及血脑屏障的破坏,降低大鼠实验性SAH后的死亡率[11-12]。过去研究显示,Cytochrome C能够促进炎性介质的释放,且Cytochrome C释放可使蛋白质在胞质内积累,造成局部渗透压增高而出现水肿。细胞色素C是一种与线粒体有关的促凋亡因子。在正常的机体生理状态下,它是一种细胞色素氧化酶,位于线粒体内侧外膜。它不仅是线粒体中参与电子传递链中的蛋白,还参与细胞凋亡过程。大量研究表明,细胞色素C参与缺血性疾病、肿瘤、多器官功能障碍综合征(MODS)患者细胞凋亡的作用受到广泛关注,并且在那些患者血清中发现其增高[13]。因此,在预测异常凋亡病理过程,血清细胞色素C浓度的变化有相当的临床意义。

线粒体释放Cytochrome C入胞质引起细胞凋亡:病理状态下,Cytochrome C自线粒体中释放入胞质中,其在胞质中聚集后可诱发细胞凋亡,这一过程是通过Bcl-2家族调节[14]。线粒体中细胞色素C的释放是由于线粒体外膜通透性增高,其形态学的改变是由于膜的硬化和隔离所致。从线粒体转移到细胞质后,细胞色素c与Apaf-1结合,从而作为Caspase的协同因子,引发JNK参与的Caspase活化级联,导致细胞凋亡[15]。在本研究中,SP600125组的Cytochrome C的表达量明显低于空白组,这提示,Cytochrome C表达与蛛网膜下腔出血后周围组织细胞凋亡有关,JNK激酶抑制剂可通过抑制JNK信号传导通路下游Cytc表达而抑制其所产生的级联反应,进而抑制神经细胞凋亡,保护神经元。

本研究结果表明了Cytochrome C在蛛网膜下腔出血后的表达,并且进一步证实了在SAH后早期脑损伤中细胞凋亡起了重要作用。在 SAH后破坏了血脑屏障结构和功能的完整性,使其通透性发生了改变,促使脑水肿的发生和发展加重,产生脑组织结构破坏及神经元损伤,导致 EBI,而JNK抑制剂 SP600125通过对蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤细胞凋亡的产物表达影响,能够在一定水平上逆转上述过程,从而实现了其在早期产生的脑损伤起到重要保护作用。因此,在临床上,我们将对蛛网膜下腔出血后出现的早期脑损伤的诊断和治疗提供了更加有利的帮助。但本实验仍存在一些不足,如目前JNK在SAH后EBI中的具体作用机制仍不明确,需要未来继续深入研究探讨。