Nrf2信号通路在白内障发生和发展中的作用

陈月芹 综述 薛春燕 审校

1南京鼓楼医院眼科,南京 210009;2东部战区总医院眼科,南京 210002

白内障是世界上主要的致盲眼病,除手术外,缺乏针对其潜在机制的有效防治方法[1]。虽然白内障病因复杂多样,其发病机制未完全阐明,但不少研究表明氧化应激损伤是导致白内障的共同因素,过度的氧化应激引起晶状体蛋白发生氧化、变性、聚集,最终导致晶状体混浊形成白内障[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是细胞内主要的抗氧化转录因子。Nrf2信号通路的激活可以上调抗氧化基因的表达,是细胞抵御氧化应激损伤的重要通路之一[3]。研究发现Nrf2信号通路异常与白内障的发生和发展有关[1,4-5]。本文就Nrf2氧化防御通路与白内障发生和发展的关系进行综述,以期为白内障的防治提供新靶点。

1 Nrf2信号通路

1.1 Nrf2信号通路构成

Nrf2是CNC(cap‘n’collar)转录因子家族中的重要成员,具有碱性亮氨酸拉链结构,是机体抵抗氧化损伤的重要转录因子之一。正常生理状态下,Nrf2在细胞质中与其抑制因子Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)结合,Keap1的DGR区与Nrf2上Neh2区中的2个基序79ETGE82(高亲和力)、29DLG31(低亲和力)结合。Tong等[6]提出这种结合方式是一种“铰链与门闩”方式,Keapl与亲和力较高的ETGE结合后,Nrf2可自由移动,其类似于“铰链”;亲和力低的29DLG31结合部位相当于“门闩”,Nrf2与之结合后其活动受到抑制,Neh2区赖氨酸残基泛素化的位置得到暴露。Keap1作为Cul3-E3泛素连接酶与底物Nrf2的连接分子,不断对Nrf2进行泛素化,泛素化的Nrf2被26S蛋白酶体降解,使Nrf2维持在一个较低的水平[6]。

1.2 Nrf2信号通路调控方式

Nrf2信号通路可以通过Keap1依赖和Keap1非依赖方式激活。

1.2.1依赖Keap1 受到氧化应激损伤时,Keap1半胱氨酸基团发生修饰,蛋白构象发生变化,Nrf2与Keap1结合,低亲和力部位29DLG31得到解离,干扰泛素的转移。继而Keap1被Nrf2饱和,Nrf2不再被降解,被释放的Nrf2在细胞质聚集。最后,Nrf2向细胞核转移,与小分子肌腱纤维瘤蛋白形成异源二聚体后与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)-Nrf2调控基因启动区域内的一个顺式增强子序列(TCAG/CXXXGC)相结合[7],继而上调其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶[如谷胱甘肽S转移酶、NADPH醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)]的表达,发挥抵御氧化损伤或解毒的作用,保护细胞免受氧化损伤。该方式是经典的激活方式。

依赖Keap1的Nrf2信号通路的激活除了与其解偶联这个方式,还可通过减弱Keap1介导的蛋白酶对Nrf2降解进行激活。氧化应激或亲电试剂使Cul3从Keap1解偶联从而抑制蛋白酶体对Nrf2的降解。一些Nrf2的激活剂,一方面能终止Nrf2被泛素化,另一方面能增加Keap1的泛素化降解[8]。

除了上述途径外,最近发现自噬通路也可以通过Keap1调节Nrf2信号通路。白内障的形成与晶状体内蛋白质的异常聚集沉积有关,自噬是清除受损蛋白的主要途径,维持晶状体的透明性可以通过调节自噬完成,调节自噬是预防白内障形成的重要途径[9]。p62是自噬的核心,是一种自噬受体蛋白,也称为“垃圾清洁工”[10-11]。在细胞质内,p62与Nrf2竞争结合Keap1,使Nrf2向细胞核转移,从而上调Nrf2下游靶基因的转录[12]。还有研究表明,p62的KIR结构域可以直接与Keap1的Kelch重复结构域结合,干扰Keap1和Nrf2的结合,使Keap1通过自噬降解,从而激活Nrf2信号途径[11]。当p62过度表达时Keap1蛋白水平下降;而通过小干扰RNA敲除p62基因后,Keap1蛋白增加、Nrf2蛋白减少(mRNA未发生改变)、Nrf2调控基因的转录和表达下降[10]。

1.2.2非依赖Keap1 (1)Nrf2发生蛋白修饰 Nrf2有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基,可以通过磷酸化、乙酰化修饰进行调节[13]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶途径可参与Nrf2的磷酸化。PKC、MAPK ERK、MAPK JNK、PERK可以磷酸化Nrf2促进Nrf2向细胞核转移激活该通路;MAPK P38可以磷酸化Nrf2促进其与Keap1结合抑制Nrf2核转移,从而抑制Nrf2信号通路。P300/CBP能够乙酰化Nrf2,从而促进Nrf2与启动子特殊DNA序列结合,启动抗氧化基因的表达,发挥抗氧化应激作用。(2)Nrf2与表观遗传 机体内表观遗传调节方式包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。DNA甲基化是DNA复制后常见的调控方法之一,是机体正常发育和分化的重要调控因子,通过DNA甲基转移酶催化完成。Liu等[14]用镍诱导小鼠肝损伤炎症模型,发现小鼠肝脏Nrf2启动子甲基化程度较高、Nrf2蛋白与其下游基因HO-1表达下调;槲皮素干预后,DNA甲基转移酶活性下降、Nrf2 DNA甲基化水平降低,Nrf2核转移增加、HO-1表达上调减轻肝脏损伤。不少研究表明,一些天然药物可以使Nrf2 DNA启动子甲基化水平降低,促进下游基因HO-1、NQO1的表达从而发挥抗氧化活性[15]。

组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生乙酰化、甲基化等修饰的过程。当组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)活性增强,组蛋白乙酰化减少,从而降低Nrf2及其靶基因的表达,导致氧化应激损伤加重;使用HDAC抑制剂可以增加组蛋白的乙酰化,从而增加Nrf2蛋白表达,减轻氧化应激损伤[16]。肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性与其可以上调细胞内组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases,HMTs)有关,HMTs可通过增加Nrf2基因组蛋白甲基化引起Nrf2表达增加,从而增加细胞的耐药性[17]。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类非编码RNA,包含22个核苷酸,可以调节靶基因的转录和翻译,从而干扰其表达[18]。目前发现与Nrf2调控有关的miRNA包括miR-144、miR-28和miR-34,这些miRNA对Nrf2有负调控作用,但具体机制尚未完全明确[18]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA,通过干预转录、转录后调节以及表观遗传的方式,调节目的基因的表达。目前发现与Nrf2调控有关的LncRNA包括:(1)UCA1、MEG3和NRAL通过扮演内源竞争RNA角色竞争相关的miRNA;(2)HOTAIR增加NFE2L2启动子组蛋白H4乙酰化;(3)TUG1直接与Nrf2蛋白相互作用;(4)NMRAL2P充当Nrf2上游以及下游一种新的功能假基因[19]。

2 Nrf2信号通路在白内障中的作用

2.1 年龄相关性白内障

氧化应激损伤和细胞抗氧化能力下降通常被认为是年龄相关性白内障发生的2个重要因素[4]。晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)自身有很强的抗氧化能力,其中Nrf2占重要地位,Nrf2系统能够清除活性氧(reactive oxygen species,ROS),维持细胞的氧化还原稳定状态[4]。Keap1可通过负性调控Nrf2的蛋白表达参与年龄相关性白内障的进展。Gao等[20]收集15～80岁白内障患者的晶状体以及LECs进行对比,发现随着年龄的增长,晶状体内Keap1含量显著上升、Nrf2表达显著下降;Keap1 DNA启动子在66～80岁的白内障人群晶状体内发生明显的去甲基化。Keap1启动子去甲基化使Keap1蛋白表达增多,增多的Keap1使Nrf2降解增多,Nrf2水平的降低导致其下游抗氧化酶表达减少,晶状体氧化防御系统功能受到抑制,最终引起白内障。Elanchezhian等[21]将LECs暴露于高浓度同型半胱氨酸建立年龄相关性白内障体外模型,发现高浓度同型半胱氨酸能引起LECs内质网产生应激反应、慢性非折叠蛋白质反应、ROS升高和Nrf2降解,从而阻断Nrf2对LECs的氧化防御反应。升高的ROS超过了Nrf2的抗氧化能力从而引起晶状体的过度氧化,最终导致年龄相关性白内障的发生。Ma等[22]发现,过表达Nrf2的LECs对过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)引起的细胞形态和活性损伤的抵抗能力增强,上调Nrf2的表达有望延缓LECs的老化和年龄相关性白内障的发生。该研究团队发现细胞内升高的ROS能够启动PERK信号通路并诱导下游Nrf2和ATF4的磷酸化;此外,ATF4能够促进Nrf2与ARE结合,上调抗氧化物以及抗氧化酶的表达,减轻细胞氧化损伤。由此可见,随着年龄的增长,晶状体内一些产物可以通过直接或间接机制下调Nrf2通路活性,使晶状体发生氧化应激损伤,导致白内障的发生和发展。Chhunchha等[23]发现,年龄大的人LECs缺乏Bmal1蛋白,该蛋白的缺失会引起Nrf2/ARE调控的抗氧化基因,如过氧化物氧还蛋白6(peroxiredoxin-6,Prdx6)表达水平逐渐下降,最终导致ROS升高、细胞氧化损伤加重、细胞死亡。该研究团队在动物模型中还发现晶状体内Bmal1/Nrf2/Prdx6和Ⅱ相抗氧化酶表达的变化与24 h节律有关,这些蛋白表达的变化可影响ROS的表达水平。Choi等[24]采用亚硝酸钠注射幼鼠皮下诱导年龄相关性白内障的在体模型,结果发现模型组晶状体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性下降,丙二醛升高,细胞核Nrf2表达下降。笃斯越桔可以通过激活Nrf2/HO-1通路呈剂量依赖性地减轻亚硝酸钠引起的氧化应激损伤,从而发挥减轻白内障的作用。以上在体、体外研究均表明,Nrf2信号通路与年龄相关性白内障的发生和发展密切相关。由于年龄增大、过强的氧化应激等因素引起LECs以及晶状体内Nrf2信号通路的激活受到抑制,使其下游抗氧化基因转录和表达下降、氧化防御能力下降,LECs以及晶状体组织氧化损伤加重,最终导致晶状体由透明变混浊。

2.2 糖尿病性白内障

糖尿病也是白内障发生和发展的重要因素,长期高血糖引起机体多条代谢途径紊乱,产生过量ROS,过量的ROS又进一步加重这些代谢途径的紊乱,形成恶性循环;当ROS产生过量超过晶状体的抗氧化防御能力,即会引起晶状体氧化应激损伤,导致白内障的形成。Palsamy等[25]研究发现,在糖尿病患者中,高血糖使患者体内产生大量ROS,引起晶状体内Keap1启动子去甲基化,Keap1蛋白表达增加,负性调控Nrf2信号通路。该研究团队发现糖尿病患者晶状体皮质、核以及后囊膜中Keap1 DNA启动子甲基化的5-mc降低90%,而该变化与年龄无关。Ma等[26]采用链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型并用klotho干预,发现klotho治疗后糖尿病大鼠白内障程度减轻,这与klotho能激活Nrf2信号通路、增强晶状体的氧化防御能力有关[26]。Sun等[27]和Feng等[28]采用D半乳糖诱导糖尿病性白内障的动物模型,发现模型组晶状体混浊程度升高,Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表达水平下降,羟苯磺酸钙和海藻酸寡糖能通过激活晶状体内Nrf2通路上调HO-1的表达,减轻晶状体混浊程度。以上细胞和动物实验均一致表明,高糖能够通过多种方式引起Nrf2蛋白表达减少,抑制Nrf2信号通路,从而下调其下游抗氧化基因的转录和表达,引起晶状体的氧化损伤,导致白内障的发生和发展。

2.3 其他类型白内障

其他一些因素,例如辐射、药物、高度近视也可引起白内障,这些致病因素均可通过调控Nrf2信号通路活性参与白内障的发生和发展。Sun等[29]采用紫外线照射LECs建立紫外线对晶状体辐射损伤的体外模型发现,miR-4532抑制剂能够通过激活SIRT6-Nrf2通路减轻紫外线对LECs的氧化损伤,miR-4532-SIRT6-Nrf2有望发展成为治疗晶状体紫外线损伤的新靶点。近期流行病学研究发现,抗癫痫药物丙戊酸与白内障的发生有关,Palsamy等[30]用丙戊酸体外作用于LECs发现,丙戊酸可以通过修饰DNA去甲基化酶使Keap1启动子去甲基化,Keap1表达升高,从而抑制Nrf2并下调其下游抗氧化酶,如过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶的表达,细胞内ROS升高,导致细胞凋亡,最终引起白内障的形成。Zhu等[31]将高度近视白内障患者LECs和年龄相关性白内障患者LECs的抗氧化基因的甲基化水平进行对比发现,高度近视组DNA甲基转移酶1水平升高,GSTP1和TXNRD2这2个Nrf2调控的抗氧化基因启动子CpG区域高度甲基化,导致GSTP1和TXNRD2表达下降,最终引起细胞抗氧化能力下降。他们推测高度近视患者白内障发生较早的原因在于高度近视患者玻璃体液化发生早,导致晶状体较早地暴露于高氧环境,容易受到氧化应激损伤,持续的氧化应激损伤使抗氧化基因发生甲基化,抗氧化酶蛋白水平下降,细胞氧化损伤加重,最终导致白内障发生。以上研究表明,Nrf2信号通路可能通过调控LECs和晶状体的氧化防御能力参与放射性白内障、药物性白内障以及高度近视性白内障的发生和发展。

3 Nrf2激活剂与白内障

目前已有不少研究证明Nrf2激活剂能够抑制、延缓白内障的发生和发展。一些中药和化合物有激活Nrf2通路的作用,通过上调下游抗氧化蛋白的表达,抑制晶状体的氧化损伤。Park等[32]采用H2O2干预建立LECs氧化损伤的年龄相关性白内障的体外模型,结果发现桑色素(Morin,3,5,7,2',4'-五羟黄酮)和金丝桃苷(一种类黄酮)可以通过激活LECs的ERK-Nrf2信号途径,促进Nrf2向细胞核转移,与ARE结合后上调HO-1的表达抑制氧化应激反应,发挥减轻H2O2引起LECs氧化损伤的作用。Liu等[33]发现异硫氰酸酯(萝卜硫素)也能通过激活Nrf2信号途径促进其核转移,上调其下游抗氧化酶NQO1和TXNRD1的表达,减轻H2O2引起LECs DNA链的断裂和晶状体混浊的程度。Liu等[34]用高糖诱导糖尿病性白内障的细胞模型,发现金樱子提取物(RLM)能够通过激活Nrf2/HO-1信号途径清除ROS、提高线粒体膜电位,减轻高糖引起的LECs氧化损伤发挥细胞保护作用。Wang等[35]研究发现,丁苯酞可以通过上调糖尿病大鼠晶状体内Nrf2、硫氧还蛋白、过氧化氢酶蛋白水平,抑制氧化应激反应,延缓糖尿病性白内障的发生和发展。Elanchezhian等[36]采用动物模型发现,乙酰左旋肉碱可以通过激活Nrf2通路、上调其下游抗氧化蛋白的表达,从而预防白内障的发生。以上在体、体外模型表明,不少化合物可以作为Nrf2信号通路的激活剂促进Nrf2向细胞核转移,上调其下游抗氧化基因的表达,提高氧化防御能力,抑制多种因素引起的LECs和晶状体的氧化损伤,达到延缓及减轻年龄相关性、糖尿病性等多种白内障的作用。

综上所述,Nrf2信号通路在白内障中发挥着重要的保护作用,可以将其作为预防、延缓白内障的新思路和新靶点。今后的研究可以考虑将以上Nrf2激活剂进行加工、修饰,使其高效性和特异性得到提高,甚至可以将其开发为滴眼液、眼膏等眼局部药物,避免全身用药的不良反应。Nrf2信号通路的上游调控机制目前仍不明确,且该通路与表观遗传学之间的关系研究仍不深入,Nrf2信号通路与白内障发生和发展的关系仍需进一步研究,从而为Nrf2信号通路作为白内障防治靶点提供更多的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突