T盒转录因子3和5基因多态性与指长比的关联性*

杨梦怡 牛世博 张 静 彭 亮 党 洁 霍正浩 陆 宏

（宁夏医科大学教育部生育力保持省部共建重点实验室，基础医学院，银川 750004）

人类第2指和第4指长度之比（2D∶4D）被公认为产前性激素暴露水平的一个宏观生物标志物[1]，不仅与一些体质性状或心理特征密切相关，且与神经、心血管、生殖等系统某些性激素依赖疾病的发生风险有一定关联[2-6]。近年研究发现，2D∶4D 的发育可能受某些相关基因（如LIN28B基因[7]、SMOC1基因[8]和AR基因[9]等）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的影响，但这些基因如何调控指长比的形成尚不清楚。T盒转录调控因子（T-box transcription factor，TBX）蛋白家族是胚胎发育过程中所必需的，其编码基因TBX可通过启动子或增强子区域激活或抑制不同的靶基因来调节个体胚胎的发生[10]。其中，TBX3和TBX5基因对脊椎动物胚胎，尤其是前肢和后肢的发育具有极其重要的调控作用[10]。以往对鸡胚胎进行的实验表明，TBX3基因可通过对BMP和Shh信号通路的调控，参与其Ⅳ趾和Ⅲ趾的正常发育[11]。而TBX5基因在包括斑马鱼[12]、鸡[13]和小鼠[14]在内的一些脊椎动物中，也被证实对诸如骨骼、指（趾）骨等的形成至关重要。为确定TBX3基因和TBX5基因是否参与人类指长比（2D∶4D）的发育，本研究对2D∶4D 与TBX3和TBX5基因5个SNP在宁夏人群的分布特征及其间的关联性进行了比较分析，以期初步探讨人类指长发育的生物学基础，为今后的相关研究提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

经宁夏医科大学伦理委员会批准，遵循“知情同意”原则。选取在校汉族学生799 人作为研究对象，其中男性398 人，女性401 人，年龄16～26 岁，平均年龄（19.51±1.23）岁。所有研究对象均为祖籍宁夏的健康个体，并自我报告双亲间3 代内无血缘关系。排除手部残疾者或手部精细结构缺失者。

1.2 指长的测量及2D∶4D 的计算

采用数码相机拍摄研究对象双手掌面照片[9]。将照片导入图像分析软件（Image-Pro Plus 6.0）测量2D 和4D。每个样本测量2 次（r＞0.95），取平均值，分别计算左手2D∶4D 和右手2D∶4D。

1.3 TBX3/TBX5 基因SNP 的筛选

采用基因组SNP 在线软件：SNPinfo Web（http：//snpinfo．niehs．nih．gov/），进行SNP 的筛选，选取r2≥0.8；最小等位基因频率≥0.05；位于基因启动子区、外显子区、5′或3′非翻译区的功能性SNP，最终纳入TBX3 基因3 个SNPs 位点（rs2242442、rs1061651、rs8853），TBX5 基因2 个SNPs 位点（rs11067101、rs6489956）进行研究。

1.4 基因组DNA 的提取

采用EDTA 抗凝采血管采集研究对象外周血2～3 mL。按照试剂使用说明，用TIANGEN 血液基因组DNA 提取试剂盒对研究对象外周血基因组DNA 进行提取，随后将DNA 滴入分光光度计（nanodrop）的微量池孔上进行浓度和纯度的测定，要求DNA 浓度大于20 ng/μL，A260/A280 的比值在1.7～1.9 之间，对符合标准的DNA 置于-20℃冰箱保存。

1.5 SNPs 位点的基因分型

采用多重聚合酶链反应技术（诺禾生物技术有限公司，北京）进行基因分型。PCR 程序分2 轮进行，一轮PCR：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，1 个循环；60 ℃ 10 min，72 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，4 个循环；60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，24 个循环；二轮PCR：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，1 个循环；60 ℃4 min，72 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，5 个循环；65 ℃ 1 min，72℃ 30 s，10 个循环。PCR 产物于Illumina X-10 测序平台上机测序。随机抽取5%的样本进行重复检测，分型一致率应为100%。

1.6 统计学处理

受试者的群体代表性采用Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验，χ2检验比较基因型频率和等位基因频率；独立样本t检验比较2D∶4D 均值的性别差异；单因素方差分析评估2D∶4D 与SNPs 位点多态性间的关联性。应用SPSS 25.0 软件包对所有数据进行统计学分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2D∶4D 均值在不同性别间的比较

2D∶4D 均值在不同性别间的分布见表1。结果显示，女性左手2D∶4D 和右手2D∶4D 的变化范围基本相当，但均值均显著高于男性（P＜0.01）。

表1 不同性别间2D∶4D 均值的比较[±s （min～max），mm]

表1 不同性别间2D∶4D 均值的比较[±s （min～max），mm]

*P＜0.01 vs 男性

组别n左手右手男性3980.960±0.037（0.727～1.060）0.964±0.035（0.835～1.060）女性4010.969±0.034（0.876～1.097）*0.971±0.034（0.882～1.063）*

2.2 TBX3/TBX5 基因5 个SNPs 位点多态性分布在不同性别间的比较

H-W平衡检验表明，本研究所选各位点均具有良好的群体代表性（P＞0.05）。不同性别间5个SNPs位点多态性分布的比较结果显示，TBX3/TBX5基因rs2242442、rs1061651、rs8853、rs11067101、rs6489956 5 个SNPs 位点各基因型及等位基因频率在两性间的分布规律相似，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 不同性别间TBX3/TBX5 基因5 个SNPs 位点多态性分布的比较[n （%）]

2.3 2D∶4D 与TBX3/TBX5基因5个SNPs位点多态性的关联性分析

宁夏大学生2D∶4D 与TBX3/TBX5 基因5 个SNPs 位点多态性关联性分析结果显示：不论男性或女性，TBX3/TBX5 基因5 个SNPs 位点多态性与左手2D∶4D 和右手2D∶4D 均无显著关联（P＞0.05）（表3）。

表3 不同性别2D∶4D 与TBX3/TBX5 基因5 个SNPs 位点多态性的关联性分析（±s，mm）

表3 不同性别2D∶4D 与TBX3/TBX5 基因5 个SNPs 位点多态性的关联性分析（±s，mm）

基因SNP 位点基因型男性 （n=398）女性 （n=401）左手2D∶4D右手2D∶4D左手2D∶4D右手2D∶4D TBX3rs2242442GG0.961±0.0370.970±0.0350.964±0.0310.968±0.035 GA0.959±0.0390.963±0.0360.970±0.0320.972±0.034 AA0.962±0.0310.961±0.0320.971±0.0420.972±0.033 rs1061651TT0.957±0.0400.961±0.0370.967±0.0330.972±0.036 TC0.962±0.0350.967±0.0330.967±0.0360.970±0.034 CC0.959±0.0370.965±0.0340.974±0.0290.973±0.032 rs8853TT0.959±0.0340.966±0.0320.972±0.0320.971±0.032 TC0.961±0.0350.964±0.0350.966±0.0350.970±0.034 CC0.959±0.0460.963±0.0400.969±0.0340.975±0.037 TBX5rs11067101GG0.963±0.0340.967±0.0330.966±0.0340.970±0.033 GA0.959±0.0350.963±0.0360.970±0.0330.971±0.035 AA0.958±0.0450.965±0.0350.973±0.0360.975±0.035 rs6489956CC0.962±0.0370.965±0.0340.970±0.0340.972±0.034 CT0.952±0.0320.964±0.0360.963±0.0310.967±0.034 TT0.975±0.0400.964±0.0410.951±0.0380.970±0.033

3 讨论

指长比（2D∶4D）的发育受产前睾酮（prenatal testosterone，PT） 或产前雌激素（prenatal estrogen，PE）暴露水平的影响[15]。女性的2D∶4D通常比男性高[16]，本研究结果再次验证了2D∶4D的性别差异性这一特征。此外，有研究显示，右手2D∶4D 对PT（PE）暴露水平的敏感性更强，更能体现产前性激素对指长发育的影响[17]。在本研究中，双手2D∶4D 均被发现可反映PT（PE）的暴露水平。

作为T-box 基因家族中对脊椎动物肢体发育的重要调控基因，人类TBX3 或TBX5 基因的突变与某些疾病的发生密切相关[18-19]。例如，TBX3 基因突变可导致尺骨-乳腺综合征，患者除乳腺缺损等主要症状外，亦可出现指骨、掌骨缺如或发育不良，指间关节屈曲挛缩畸形，且有并指症的倾向[18]。而TBX5 基因突变则可导致心-手畸形综合征，患者除心发育缺陷外，还表现出前肢缺陷，包括桡骨发育不全和指骨缺失等异常特征[19]。这些结果提示，TBX3 和TBX5 基因不仅在人类四肢骨（包括指骨）的发育过程中扮演着重要的角色，且参与了其不同形态模式的决定。此外，临床研究表明，T-box 基因碱基的遗传变异可能导致其表达水平的改变，从而影响人类某些性激素相关疾病的发生[20]。例如，Fernandez-Moya 等[21]研究智利人群TBX3 基因多态性对乳腺癌的作用时，显示该基因rs2242442 位点杂合子GA 和G 等位基因携带者患乳腺癌的风险显著降低，提示G 等位基因在乳腺癌的发生过程中可能具有保护作用。Wang 等[22]对中国汉族人群的研究显示，TBX5 基因rs6489956 C＞T 变异与先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）遗传易感性的增加相关，CT 和TT 基因型携带者CHD 的发病风险是CC 基因携带者的1.83 倍（OR=1.83，95% CI：1.48～2.28）。上述与TBX3 和TBX5 基因多态性有关的性激素依赖性疾病亦被报道与指长比间存在相关性[5，23-24]。由此推测，TBX3 和TBX5基因位点多态性变化与2D∶4D 形成之间可能存在某种潜在的联系。本研究分别对TBX3 基因3 个SNPs 位点和TBX5 基因2 个SNPs 位点多态性与宁夏大学生2D∶4D 间的关系进行了分析，遗憾的是，无论在男性还是女性，均未见两者之间存在显著关联。由于目前上述2 个基因多态性与人类指长发育关系的相关研究在国内外尚未见报道，故我们对本文中阴性结果产生的真正原因暂时还难以给出一个令人满意的解释。动物模型实验显示[25-26]，Tbx3 和Tbx5 基因分别与T-box 家族成员中另外2个基因Tbx2 和Tbx4 同源，相互之间的功能密切相关。有研究发现，Tbx2 和Tbx3 基因在鸡趾骨等多种组织中具有类似的表达模式[25]；而小鸡Tbx4 异常表达后观察到的足趾异常、发育不全和/或桡骨缺失与人类TBX5 基因突变导致的表型亦相近[26]。这些现象说明，除了Tbx3 和Tbx5 基因外，Tbx2和Tbx4 基因可能也共同参与了对动物指（趾）骨发育过程的调控。据此我们初步分析，本文中未能发现TBX3 和TBX5 基因多态性与2D∶4D 间显著关联的主要原因之一，可能源于研究中仅单独考虑了T-box 基因家族中TBX3 和TBX5 两个基因对2D∶4D 形成的影响，而忽略了其同源基因TBX2 和TBX4 在指骨发育过程中与它们的协同作用。此外，本文中选取的TBX3 和TBX5 基因各SNPs 的数量相对有限，可能还不足以较全面体现这2 个基因多态性与2D∶4D 间的真正关系。这些也提示在后续研究中，应适当扩大对T-box 基因家族成员中相关基因及SNP 位点的纳入范围，通过基因互作、连锁分析等方法在不同人群中对二者间的关系进行更加完善的分析和探讨，将对更好的从分子遗传学角度阐释2D∶4D 的生物学发生基础及其与相关疾病的发生机制具有重要意义。

综上所述，本研究虽未见TBX3、TBX5 基因家族中的5 个SNP 对宁夏人群2D∶4D 的形成具有明显作用，但仍不能完全否认TBX3 和TBX5 基因多态性与指长比间可能存在的潜在关联。基于T-box 基因家族在人类肢体（骨骼）发育过程中的重要作用及这些基因变异与人类性激素相关疾病的密切关系，其与2D∶4D 间的关联性依然需要此领域相关学者的共同努力去明确。