骨髓间充质干细胞在骨缺损疾病治疗中的应用进展

罗家利 吕帅洁 童培建

由创伤、感染或肿瘤切除等因素引起的骨缺损一直是临床骨科面临的重大难题，目前自体骨移植仍是骨修复的常用治疗方式。但自体骨移植存在多种问题，如手术操作繁琐，自体骨数量局限，治疗效果及预后不理想等，因此亟需寻求一种新的有效疗法来治疗骨缺损疾病[1-2]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种具有多向分化潜能的细胞，在骨组织工程领域备受关注。近年来，有关BMSCs 治疗骨缺损的研究取得了显著成果，并已证明此疗法能有效修复骨与软骨缺损[3-4]。本文结合近年国内外BMSCs 的相关临床研究进展进行综述。

1 BMSCs 定义与生物学特性

BMSCs 是存在于骨髓基质中的一种具有自我更新和多向分化潜能的基质细胞[5]。大量研究证明，无论是在动物模型还是在人类临床试验中，BMSCs 作为多功能干细胞在骨缺损的维持、修复、再生中具有多种优势[6]。BMSCs 在骨缺损治疗中的主要特性为：（1）多向分化和自我更新能力：在一定条件诱导下，BMSCs 能够分化为成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞促进骨修复[7]。（2）归巢能力：BMSCs 能够迁移到损伤部位，分泌有助于组织再生的趋化因子、细胞因子以及生长因子，参与损伤区域重建[8]。（3）免疫调节特性：BMSCs 参与免疫调节，与损伤部位脱落分子产生强大的旁分泌效应，阻断并保护其他细胞免于凋亡[9]。

2 BMSCs 分离与鉴定

BMSCs 因其干细胞特性和高度可塑性等优点而逐步走向临床，在体外扩增之前，从不同外周组织中分离与鉴定BMSCs 是获得足够材料进行临床应用的关键先决条件。BMSCs 体外分离方法主要有骨髓细胞贴壁法、密度梯度离心法、膜过滤分离法等[10]。这些方法各有优劣，目前从骨髓中分离BMSCs 的常用方法为密度梯度离心法，此种方法的优点是不需要特殊标记介质，能有效降低对分离后细胞的影响。但与其他方法相比，密度梯度离心法不能分离具有相似沉降特性的不同类型细胞[11-12]。由于缺乏唯一特异性标志物，目前对BMSCs 的鉴定方法尚未统一。国际细胞治疗学会（ISCT）在2006 年提出了BMSCs的最低定义标准[13]：（1）BMSCs 必须具有贴壁黏附性；（2）BMSCs 必须表达CD73、CD105 和CD90，但不表达造血和内皮细胞标志CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、人类白细胞抗原-DR；（3）BMSCs 必须具有在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨母细胞的能力。

3 单纯BMSCs 移植应用

临床用于重建大块骨缺损的治疗选择主要包括骨移植和Ilizarov 牵引成骨技术，但均存在诸多限制。在骨组织工程领域，利用BMSCs 诱导骨再生修复骨缺损已受到广泛关注[14-15]。依据骨化途径，BMSCs的移植应用可分为膜内植入（直接成骨）和软骨内植入。

3.1膜内植入 膜内植入为将未分化的BMSCs 单纯植入破损骨膜内，使其分化为骨祖细胞形成成骨中心并分泌类骨质捕获成骨细胞，诱导成骨细胞分化为骨细胞，最终修复缺损骨小梁基质和骨膜。Gjerde等[16]将BMSCs 在含有人血小板裂解物的培养液中进行扩增，并植入破损骨骨膜下，在骨缺损愈合后对移植部位进行活检，结果显示，BMSCs 膜内植入显著诱导了新骨形成，且未观察到不良反应。Zhao等[17]从兔外周血和骨髓中分离纯化BMSCs 和内皮组细胞进行共同培养，然后将BMSCs 植入部分脱蛋白的生物骨支架，结果显示，共培养的内皮祖细胞与BMSCs 在支架表面生长良好，与单独培养的BMSCs组相比，共培养组在促进骨缺损修复的同时，还诱导了支架上胶原蛋白生产，加速血管和骨的形成。

3.2软骨内植入 骨化涉及BMSCs 的初始凝聚和最终钙化骨的形成，膜内植入直接完成了这一点，而软骨内植入则增加了一个中间步骤，使BMSCs 向成软骨细胞分化，分泌基质形成软骨板和软骨膜，以此来调节缺损骨骼的生长和最终形态。通过将预分化的BMSCs 移植到软骨形成途径诱导软骨内成骨是近年来的研究重点[18-20]。研究表明，相较于膜内植入，软骨内植入能够显著促进血管与骨的形成，且更为可控[21]。Harada等[15]将体外预分化的BMSCs 移植到软骨内形成间充质干细胞来源的软骨细胞，并植入大鼠巨大（15 mm）全层股骨缺损中，结果显示，2 周时骨缺损处明显有新骨形成，8 周时新形成的皮质骨已成骨愈合，8 周后大鼠股骨的平均生物力学强度达到了正常大鼠股骨的75%。Farrell等[22]将全髋关节置换术患者体内提取的BMSCs 分别使用成骨细胞和软骨细胞培养基扩增，然后植入表达人胎盘碱性磷酸酶转基因大鼠体内的人工支架培养，28 d 后提取支架进行组织形态计量学计算，结果显示，成骨细胞培养组骨组织占支架构筑面积的（24±10）%，软骨细胞培养组骨组织占支架构筑面积的（39±7）%，提示体外诱导BMSCs 软骨分化进行体内骨修复效率更高。

4 BMSCs 复合支架材料应用

运用组织工程和细胞生物学的原理及方法，将人工支架材料复合BMSCs 对骨缺损组织的结构、功能进行修复和改善已取得了相关突破和进展[23]。人工支架具有良好的生物相容性、可吸收性、可降解性，运用支架将植入的BMSCs 固定在损伤部位预定局部环境有利于组织的再生和适当降解，从而克服了自体骨移植的缺点[24]。

4.1传统支架材料选择 人工支架与自体骨具有相似的理化性质，拥有良好的生物相容性并可诱导成骨分化，这些支架材料必须包含两个基本成分：（1）骨矿物，即磷酸钙和羟基磷灰石；（2）有机物，如主要的胶原纤维和成骨生长因子等。支架材料主要分为合成高分子材料和天然高分子材料两大类，合成高分子材料如纳米陶瓷、聚乙乳酸、聚乙醇酸等，天然高分子材料如胶原、明胶、壳聚糖等[25-27]。目前生物支架材料的研究热点是将不同的生物材料进行相应组合，以制备高性能复合材料，克服单一支架材料缺陷。Ruan等[24]将丝素蛋白/壳聚糖/纳米纳米羟基磷灰石（SF/CS/nHA）3D 支架材料单独或与BMSCs 复合应用于兔桡骨节段性缺损处，结果显示SF/CS/nHA可促进BMSCs 黏附、生长和钙结节形成，提示负载BMSCs 的SF/CS/nHA 支架具有较高的修复桡骨节段性缺损的效果。Zhu等[28]将由微米晶须和纳米颗粒混合结构表面（hBCP）组成的硫酸钙生物陶瓷植入犬长骨缺损模型，与传统生物支架材料进行对比，结果显示hBPC 组植入材料内有更多新骨形成并具有更高的骨折负荷，提示微米/纳米混杂结构生物陶瓷增强了局部骨缺损的修复。

4.2新兴生物支架技术 3D 生物打印支架是目前骨缺损修复领域的研究热点。3D 生物打印技术用于精确分配负载细胞的生物材料，以构建复杂的生物支架。该技术仍处于早期阶段，但3D 生物打印技术具有广泛的潜在用途，包括修复骨缺损处皮肤、软骨和骨骼[29]。在典型骨组织工程方案中，首先制造3D多孔支架，然后加载特定的活细胞和/或组织诱导生长因子以启动和促进缺损骨的再生或替换，与传统支架相比，3D 生物打印技术的主要优势在于可以制造细胞分布可控的支架[19，30]。该项技术曾被运用于制造硫酸钙支架，实验已经证明低温3D 打印硫酸钙支架的可行性，目前更多学者将研究重点放在使用3D生物打印技术改善支架生物活性、骨诱导性和机械性能上，开发更具生物针对性和连贯性的完美支架[31]。Xu等[32]尝试利用表达Osx 的病毒转染大鼠BMSCs，上调成骨相关基因，然后与包裹重组人血管内皮生长因子（VEGF）的3D 打印多孔支架结合，使支架具有血管化和成骨诱导特性，促进骨缺损修复。

5 基于基因工程的BMSCs 应用

将特定基因通过腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、杆状病毒在体外转染至BMSCs，再输入患者体内是目前基因治疗骨缺损的主要研究方向。不同有益基因的基因修饰可以改善BMSCs 在损伤部位的成骨效力与修复能力[33]。转基因BMSCs 的动物研究揭示了基因工程临床应用的可能性与广泛潜力。Kumar等[34]用腺相关病毒（AAV）载体将骨形态发生蛋白-2和VEGF 结合到BMSCs 中，并植入小鼠胫骨缺损模型中，结果显示该实验组小鼠骨修复效率、骨密度和生物力学特性均明显强于对照组，提示组合基因修饰BMSCs 具有临床潜力。将基因工程运用到生物支架目前仍处于动物试验阶段，研究发现，基因激活的纳米支架在体外和体内都能够诱导功能性基因的可控、持续释放，进而促进BMSCs 成骨分化，加速修复临界大小颅骨缺损[35]。Leng等[36]将骨诱导基因OimRNAs 与阳离子聚合物聚乙烯亚胺复合，负载于脱钙骨基质支架（Oi-mRNA/DBM）并植入大鼠临界颅骨缺损模型，结果显示转基因支架能够有效促进BMSCs 在体内渗透以及成骨分化，加速骨缺损修复。

6 小结

骨缺损疾病是骨科临床上常见的难题。大量临床实验表明，BMSCs 是治疗骨缺损疾病的理想化种子。有关BMSCs 联合生物支架、基因工程治疗骨缺损的大量临床前数据已经积累，未来BMSCs 的发展方向便是将实验研究转移到可行性临床治疗上。对于BMSCs 的研究也面临着实际问题，例如，由于患者样本数少，缺乏对照，以及大多数选择这类新兴疗法的患者通常都是经历过多次手术或失败治疗的疑难患者，因此将BMSCs 运用于骨缺损疾病治疗尚需进行大样本、高质量的临床试验进一步深入探究。尽管挑战诸多，但将BMSCs 和相关领域的基础研究转化为可行的骨缺损临床治疗仍具有可观前景。