组织蛋白酶在糖尿病及糖尿病肾病作用机制中的研究进展

李明嘉 赵苗妙 杨金奎*

(1. 首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科,北京 102600;2. 北京市糖尿病研究所,北京 100730)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是内分泌系统的一种代谢紊乱疾病,由内源性胰岛素水平缺乏或活性不足引起。随着生活水平的提高及全球老龄化,DM患病率越来越高,成为各国主要的健康负担。据统计,2019年全球约有4.63亿DM患者,达到了9.3%的全球患病率,预计到2045年,这一数字将增加到7.002亿[1]。我国DM患病率也从2013年的10.9%增长到2018年的12.4%,远高于全球估计值(8.3%)[2]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是DM患者常见的慢性微血管并发症,已成为全球慢性肾疾病(chronic kidney disease, CKD)的首要病因[3]。2017年全球有6.97亿CKD患者[4],其中DN是CKD的最常见病因。目前对于DN的治疗主要还是应用血管紧张素转换酶抑制剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂来降低肾小球内压、减少蛋白尿、保护肾功能,缺乏针对发病机制的特异性疗法。

值得注意的是,组织蛋白酶(cathepsin,CTS)与DM的发病密切相关,并参与了DM及其并发症的发生发展。研究[5]表明,缺乏组织蛋白酶S(cathepsin S, CTSS)的非肥胖糖尿病(non obese diabetes, NOD)小鼠、缺乏组织蛋白酶B(cathepsin B, CTSB)的NOD小鼠以及缺乏组织蛋白酶L(cathepsin L, CTSL)的NOD小鼠中DM发病率分别为33%、28%、0%,而野生型NOD小鼠的DM发病率为69%,差异有统计学意义。Garsen等[6]证明了缺乏CTSL的小鼠与野生型小鼠相比,前者没有出现蛋白尿、系膜基质扩张、小管间质纤维化,显示出了正常肾功能。在一项研究队列包括1 270名参与者,平均随访8年的Meta分析[7]中,尿中组织蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)含量与1型糖尿病中估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)快速下降相关,并反映肾小管间质损伤。以上证据都提示了多种组织蛋白酶参与到DM及DN的发病与进展过程。

本课题组前期致力于研究CTSL的作用与机制,前期工作利用冷冻电镜与临床患者血清揭示了CTSL在新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染中的重要作用及机制[8],并通过机器学习的方法筛选出多种CTSL抑制剂[9],证实了CTSL在感染性疾病中所发挥的重要作用。本文将对CTSB、CTSD、CTSL与CTSS,这几个研究较为广泛的分子在非感染性代谢性疾病中发挥的重要作用进行讨论,系统性回顾它们在DM及DN中的作用及机制。

1 CTS家族蛋白

一个健康生物体的维持很大程度上依赖于蛋白质的合成、成熟、执行功能和最终分解。为了完成上述过程,人类基因组编码了550多种蛋白酶和200多种内源性蛋白酶抑制剂[10],CTS就是其中的一个庞大家族。到目前为止,在人类中已发现了15类CTS,主要包括了CTS A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、O、S、V、W、Z,根据其蛋白水解机制又可分为丝氨酸蛋白酶(CTSA、CTSG)、天冬氨酸蛋白酶(CTSD、CTSE)、半胱氨酸蛋白酶(CTSB、CTSC、CTSF、CTSH、CTSK、CTSL、CTSO、CTSS、CTSV、CTSW、CTSZ)[11],其中半胱氨酸组织蛋白酶占据了组织蛋白酶家族的主要部分(图1)。

一般来说,CTS家族成员在酸性细胞器中,即在溶酶体和核内体中是稳定的,并能够高效地裂解各种底物,执行其功能。CTSB可以促进淀粉样斑块形成、降解基质从而促进病毒等进入细胞,主要与肿瘤的侵袭和转移、胰腺炎、阿尔茨海默病、呼吸道炎症性疾病、肝纤维化等疾病有关[12]。CTSD可以促进侵袭、裂解细胞外基质蛋白,主要与乳腺癌、阿尔茨海默病、神经元蜡样脂褐质沉积症等疾病有关[13]。CTSL可以降解基质、促进病毒入侵细胞,主要与肿瘤的侵袭和转移、牙龈增生等疾病有关[14-15]。CTSS可以提呈抗原、重塑结缔组织和基底膜,主要与Ⅳ型星形细胞瘤、动脉粥样硬化等疾病相关[16]。

虽然CTS普遍分布于哺乳动物细胞,但它们在组织和器官中表达水平不同,一些CTS如B、L普遍表达,而F、K、S等在细胞和组织中的分布是有限的[17]。

2 CTSB、CTSD、CTSL、CTSS在DM中的作用

CTS与DM的相关关系已得到验证。Huang等[18]通过实验发现肌肉CTSL基因在DM易感小鼠中表达增加,并与糖耐量有关。Chen等[19]发现在超重和肥胖的中国成人中,循环中CTSS浓度升高与代谢综合征密切相关。Ding等[20]分别收集了男性2型糖尿病患者及年龄匹配的健康男性人群的血浆样本,发现患者群体中血浆CTSD活性而非浓度增加,此外CTSD活性还与2型糖尿病的代谢参数显著相关(糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数和血糖),所以这些数据都指向血浆CTSD作为男性2型糖尿病的代谢调节因子。此外,Ding等[21]还在一项临床试验中证明了血浆CTSD活性与肝胰岛素敏感性呈负相关,以往认为“高胰岛素-正糖钳夹”是评估外周和肝胰岛素敏感性的金标准,由此提出血浆CTSD活性检测可能被用作人类肝胰岛素敏感性的非侵入性检查指标。一项前瞻性队列研究[22]显示较高的CTSS与胰岛素敏感性降低相关、与较高的DM发病风险相关,所以CTSS活性可能参与早期葡萄糖和胰岛素代谢异常。有研究者[23]利用蛋白质组学和基因分型数据找到了29种DM的生物标志物,其中就包括CTSD,另外一项蛋白质组学研究量化了1型糖尿病患者与其健康兄弟姐妹之间的尿液中低丰度蛋白质的差异,发现CTSB在二者中发生变化,并参与炎症和代谢过程[24]。这对于预测、诊断DM具有临床指导意义。

2.1 CTSB、CTSD、CTSL介导自身免疫反应导致1型糖尿病

早在2005年,Maehr等[25]的研究结果就已经表明CTSL活性对NOD小鼠1型糖尿病的发生至关重要。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,人和小鼠的主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHC Ⅱ)类区域是其关键易感位点,CTS生成肽,由Ⅱ类MHC分子提呈给CD4+T细胞进而引发免疫反应[26]。CTSL缺失对小鼠提供了保护作用,CTSL缺失小鼠与野生型小鼠相比,调节性T细胞比例增加,所以认为调节性T细胞与侵略性CD4+T细胞之间的失衡提供了保护作用。CT4+T细胞肽表位驱动自身免疫性疾病的鉴定一直非常困难,最近Reed等[27]提出1型糖尿病的发生与MHCⅡ类分子所呈现的肽表位相关,一些肽表位通过分泌颗粒蛋白的不同肽片段融合拼凑在一起,创建了一种新的嵌合表位。这些表位是由CTSL 消化适当的无活性颗粒蛋白片段产生的。Serpin B13是一种在胰腺上皮中表达的CTSL抑制剂。在体内外抑制Serpin B13,可通过Notch1使Ngn3+内分泌祖细胞的数量增加,并增强了向β细胞的转化。抗Serpin B13抗体可刺激胰腺中Ngn3+内分泌祖细胞的形成,并使儿童1型糖尿病进展延迟[28]。混合胰岛素肽通过胰岛素原片段与其他肽段之间的肽键在胰腺β细胞中形成,并且可以被1型糖尿病患者的CD4+T细胞以及NOD小鼠的致病性CD4+T细胞靶向。通过蛋白质组学分析,Crawford等[29]确定了CTSD、CTSL分别是驱动疾病中混合胰岛素肽特异性形成、水解的主要蛋白酶。敲除CTSB可下调自身反应性CD4+T细胞对胰腺β细胞的侵袭性,胰岛周围细胞浸润减少[30]。

2.2 CTSB、CTSL、CTSS通过多种机制导致2型糖尿病

Yang等[31]发现2型糖尿病患者循环CTSL浓度升高,并且CTSL通过降解基质纤维连接蛋白、胰岛素受体(insulin receptor, IR)和胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF-1R)参与了2型糖尿病的发病机制,提示CTSL可作为治疗靶点。Urbich等[32]指出高糖显著降低了CTSL的蛋白表达和活性,而内皮祖细胞侵入缺血组织需要CTSL将基质降解,所以这限制了内皮祖细胞改善DM新生血管的能力。2014年Lafarge等[33]发现了CTSS基因敲除鼠相较于对照组血糖显著改善,通过研究发现CTSS敲除可减少肝葡萄糖生成,可能有助于改善葡萄糖耐量,但对胰岛素敏感性没有明显影响。最近,日本学者[34]提出CTSS通过抑制肝细胞肝糖输出来改善糖代谢,并且可诱导胰高血糖素样肽-1 (glucagon like peptide-1,GLP-1)分泌,循环中的CTSS有助于改善小鼠糖代谢。由此可见有一些机制尚未得到公认,有的甚至相反。CTSB可能是通过炎症和细胞凋亡参与DM的发病过程,在敲除CTSB后,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导的细胞凋亡减轻[35]。

3 CTSB、CTSD、CTSL、CTSS在DN中的作用

3.1 CTSL介导肾小球滤过屏障损伤

DN早期表现为微量白蛋白尿,随着疾病的进展表现为持续性白蛋白尿,这提示肾小球滤过屏障受损。足细胞附着在肾小球滤过屏障的外层,是维持肾小球滤过屏障完整性的主要成分[36]。由于它们是终末分化细胞,在体内没有增殖能力,因此足细胞的损伤和丢失在DN进展过程中发挥重要作用[37]。CTSL可降解维持足突正常结构的蛋白,如突触蛋白(synaptopodin)[38]、动力蛋白(dynamin)[39],进而介导蛋白尿表型。环孢素A可通过阻断CTSL介导的足细胞突触蛋白降解来预防蛋白尿[10]。

3.2 CTSB促进近端小管重吸收蛋白质的降解

在DM患者中,近端小管暴露于大量的营养物质中,易发生营养超载,进而导致肾小管肥大、损伤[40],CTSB在内皮细胞和肾小管近端高表达[41]。然而在DM早期,肾小管细胞因CTSB活性降低而导致蛋白分解降低。此外,CTSB被证明参与尿调素肽的形成[42],它们具有肾特异性并表现出促炎活性,在DN早期变化中可能发挥作用;在病变晚期,白蛋白发生结构变化,可抑制CTSB功能,导致溶酶体功能障碍并进一步造成损伤[43]。研究[44]表明经肾小球滤过后的CTSB可被低密度脂蛋白受体相关蛋白1和巨蛋白(megalin)捕获,随后内化入细胞,并通过M6P通路进入溶酶体,继续发挥蛋白水解功能。

3.3 CTSB、CTSS介导基质蛋白降解和内皮损伤

CTSB有助于DM肾组织中纤连蛋白(fibronectin)的降解从而缓解病理改变[45]。CTSS是单核-巨噬细胞来源的循环中蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor-2, PAR-2)激动剂,与DM微血管并发症相关。其致病机制主要是通过内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表达下调、内皮对白蛋白的通透性增加所致[46-47]。

3.4 CTSL创造慢性炎症微环境

CTSL可以激活乙酰肝素酶(heparanase),裂解硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS),硫酸乙酰肝素在基底膜和各种细胞表面丰富表达,并作为多种生物活性分子的协同受体发挥作用[6]。既往,人们认为乙酰肝素酶通过降解肾小球基底膜上的HS导致DN,但越来越多的数据[48]表明乙酰肝素酶的激活形成了一个慢性炎症微环境,保护了巨噬细胞的异常激活、 防止炎症消退,通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)途径来激活巨噬细胞,随后NF-κB通路被激活,促进了TNF-α的表达,由此介导了炎症反应、肾损伤。

3.5 CTSD、CTSL促进晚期糖基化终产物的降解

晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)是还原糖和活性醛与蛋白质、脂类和核酸发生非酶促反应的最终产物,在DM中有所积累。AGEs通过与受体结合或被炎症细胞内化产生活性氧(reactive oxygen species, ROS),同时诱导细胞因子的释放,促进炎症反应。Grimm等[49]的研究表明,施加AGEs刺激后,细胞中溶酶体数量增多、溶酶体蛋白酶活性增强,CTSD mRNA水平增高、成熟体增多;CTSL mRNA不变、成熟体增多。因此CTSD、CTSL可降低AGEs的毒性。

4 抑制CTS的小分子药物的研究现状

鉴于CTS在疾病中所发挥的巨大作用,开发CTS抑制剂一直都是研究的热点。近年来,新药的开发虽然取得了一些进展,但仍存在一些缺陷:①治疗剂量的CTS抑制剂对细胞有毒性作用;②广谱的CTS抑制剂可能会导致其他不良反应;③可能存在生物利用度低的问题[50]。下面对本文中重点介绍的几种CTS抑制剂研发现状进行介绍。

目前临床应用的CTSS抑制剂是来自罗氏公司的Compound RO5459072[51],它基于原有的化合物结构进行改造,增加了药物的体内稳定性和代谢参数,该药物已在乳糜泻、干燥综合征等自身免疫性疾病的临床试验中进行测试[52]。通过口服RO5461111(也是一种CTSS抑制剂)两个月,治疗组2型糖尿病db/db小鼠中蛋白尿较对照组减少了60%,治疗期间产生的稳定血浆浓度为400～600 ng/mL[53]。Kwork等[54]揭示了一种完全人源化的抗CTSS抗体Fsn0503 h,介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC),也是抑制CTSS的一种候选药物。

目前已知的天冬氨酸蛋白酶抑制剂是来自放线菌的蛋白酶抑素A,但由于其非特异性,可能会引起不良反应,然而在哺乳动物中还没有已知的CTSD内源性抑制剂[55]。中药的某些有效成分已被证明可下调CTSD的表达[56],黄酮类化合物水合桑葚苷、番石榴等成分可抗氧化、抗炎症,最近已被证明可以抑制慢性肾损伤小鼠肾中的CTSD[57]。最近,以蛋白酶抑素A为基础设计出了一种大环拟肽类抑制剂,与蛋白酶抑素A相比,它们在纳摩尔范围内抑制CTSD,而没有毒性[58]。另外,还通过机器学习的方法筛选出许多种候选化合物,但缺乏体内外验证的数据。

CTSB抑制剂作为潜在的抗癌和抗转移剂曾一度受到追捧,但至今仍未开发出共价可逆特异性的抑制剂。目前文献[59-60]中常用到的CTSB抑制剂为CA-074/CA-074Me,半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为2～5 nmol/L。有学者[50]提出了新型CTSB抑制剂,不过与CA-074/CA-074Me相比,还相差甚远(IC50分别为:<1 μmol/L、8～125 nmol/L)。

和CTSB一样,目前缺乏特异性针对CTSL的抑制剂,到目前为止还没有用于临床的CTSL抑制剂。本课题组从小分子文库、天然化合物中筛选CTSL抑制剂,并通过结构优化、分子改造(引入腈基)来提高候选分子的活性、选择性和可逆性。不过这些分子的药代动力学、药物效应学还不够完善,有待于进一步验证。

随着对致病机制的深入了解,将会有越来越多的CTS抑制剂进入临床试验。这将为治疗DM、DN,甚至其他疾病提供新的思路。

5 结语

本文重点回顾了CTSB、CTSD、CTSL、CTSS与DM及DN的关系及其背后的作用机制。CTSB、CTSD、CTSL、CTSS有可能作为预测、诊断和治疗疾病的重要分子。尽管目前的研究已取得可喜的进展,但关于组织蛋白酶致病机制及药物开发方面的研究还有巨大的空间。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明李明嘉:提出研究思路,撰写论文;赵苗妙:提出研究思路,撰写论文;杨金奎:提出研究思路,论文总体把关、审定。