薯蓣皂苷通过调控PDCD4对高糖诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

李亚南 刘小勇

(1河南省中医院周围血管科,河南 郑州 450003;2洛阳市第一中医院周围血管科)

糖尿病血管病变是一种高血糖持续的慢性血管系统疾病,长期在高糖条件下,血管内皮细胞功能代谢紊乱,与糖尿病的并发症和发病机制密切相关,如神经病变、肾病、心力衰竭和视网膜病变等〔1,2〕。糖尿病引起的血管内皮细胞凋亡是糖尿病性周围血管病变疾病发生的重要原因,长期血糖浓度不稳定,易造成血管内皮结构破坏,影响其正常功能〔3〕。薯蓣皂苷(DIO)具有护肝、调节糖尿病性周围血管病变功能、降血脂、抗炎和抗肿瘤等药理疾病〔4〕。DIO可以通过抑制Wnt通路进而影响脂多糖诱导对大鼠系膜细胞MC增殖的作用〔5〕。苏健等〔6〕研究结果显示,DIO可以抑制氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞EC的凋亡,进而起到保护的作用,但是在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的研究机制尚不清楚。程序性细胞死亡(PDCD)4位于染色体10q24上,是细胞凋亡因子,可以抑制细胞的凋亡〔7〕,PDCD4在高糖诱导的血管内皮细胞HUVEC中表达上调,下调PDCD4可以促进高糖诱导的血管内皮细胞中增殖,抑制其细胞凋亡〔8〕。本研究通过选取HUVECs建立高糖模型,研究薯蓣皂苷通过调控PDCD4对高糖诱导的血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 HUVECs购自中国科学院上海细胞研究所;胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司;DIO购自广州左克生物公司;葡萄糖购自北京百欧博伟公司;LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司;噻唑蓝(MTT)试剂盒购、凋亡试剂盒自上海碧云天生物公司;PDCD4抗体、p21抗体、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体和GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;Trizol试剂盒购自北京索莱宝公司;反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司。si-NC、si-PDCD4、pcDNA和PDCD4购自广州瑞博公司;引物购自上海吉玛公司。

1.2细胞培养与分组 HUVECs常规复苏后,置于培养箱内37 ℃、5%CO2进行培养,且含有10%胎牛血清的DMEM培养基,并加入胰蛋白酶消化传代培养。取对数生长期的HUVECs调整密度至5×105个/ml后,接种到96孔板中,然后将HUVECs分组,分为对照组(加入葡萄糖浓度为5 mmol/L处理)、高糖组(加入葡萄糖浓度为30 mmol/L处理)、高糖+DIO-L组(加入DIO 5 μg/ml,进行高糖处理)、高糖+DIO-M组(加入DIO 15 μg/ml,进行高糖处理)、高糖+DIO-H组(加入DIO 30 μg/ml,进行高糖处理),高糖+si-NC组(转染si-NC后进行高糖处理)、高糖+si-PDCD4组(转染si-PDCD4后进行高糖处理)、高糖+DIO+pcDNA组(转染pcDNA后进行高糖和DIO 30 μg/ml处理)、高糖+DIO+PDCD4组(转染PDCD4后进行高糖和DIO 30 μg/ml处理)。HUVECs细胞转染参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书操作进行,转染48 h,收集HUVECs进行后续实验使用。

1.3MTT检测细胞活力 收集HUVECs,加入胰蛋白酶消化后,将重悬的细胞调整密度至5×104个/ml,接种到96孔板中,继续培养48 h后,每孔以20 μl加入MTT溶液,然后继续培养4 h,继续加入二甲基亚砜(DMSO)溶液150 μl,震荡后在酶标仪490 nm波长处检测细胞的光度值,并计算细胞活力。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集HUVECs,消化重悬细胞后,调整细胞浓度至2×105/ml,然后加入500 μl磷酸盐缓冲液。参照凋亡试剂盒说明书,分别加入5 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)和10 μl碘化丙啶(PI),15 min后在流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5Western印迹检测PDCD4、p21、Bax和Bcl-2蛋白表达 收集HUVECs,加RIPA蛋白裂解液,冰上反应30 min后,提取各组细胞总蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)试剂检测蛋白的浓度。然后将蛋白样品上样凝胶电泳处理后,转膜后,脱脂牛奶封闭培养1.5 h。加入一抗PDCD4抗体、p21抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体和GAPDH抗体,孵育过夜后,加入二抗,孵育2 h后,加入电化学发光液,显影。通过Quatity One软件蛋白条带灰度值。

1.6实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PDCD4 mRNA的表达 收集HUVECs,通过Trizol法提取细胞的总RNA,检测其RNA浓度,反转录合成cDNA,然后以cDNA模板按照荧光定量试剂盒进行PCR扩增。以GAPDH为内参,通过2-△△Ct计算PDCD4 mRNA表达。

1.7统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1DIO对高糖诱导HUVECs增殖的影响 与对照组相比,高糖组细胞活力明显降低,p21蛋白表达明显增加(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+DIO-L组、高糖+DIO-M组和高糖+DIO-H组细胞活力均明显增加,p21蛋白表达均明显降低(均P<0.05),见图1、表1。

表1 DIO对高糖诱导HUVECs增殖的影响

1～4:对照组、高糖组、高糖+DIO-L组、高糖+DIO-M组、高糖+DIO-H组;图2同图1 DIO对高糖诱导HUVECs细胞的p21蛋白的影响

2.2DIO对高糖诱导HUVECs凋亡的影响 与对照组相比,高糖组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均明显增加,Bcl-2蛋白表达明显降低(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+DIO-L组、高糖+DIO-M组和高糖+DIO-H组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均明显降低,Bcl-2蛋白表达均明显增加(均P<0.05),见图2、图3、表2。因此,本研究以DIO浓度选取30 μg/ml进行后续实验。

表2 DIO对高糖诱导HUVECs凋亡的影响

图2 DIO对高糖诱导HUVECs细胞凋亡的影响

1～5:对照组,高糖组,高糖+DIO-L组,高糖+DIO-M组,高糖+DIO-H组图3 Western印迹检测各组Bax、Bcl-2蛋白表达

2.3DIO对高糖诱导HUVECs PDCD4表达的影响 与对照组相比,高糖组PDCD4 mRNA和蛋白表达均明显增加(P<0.05);与高糖组相比,高糖+DIO组PDCD4 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05),见图4、表3。

表3 DIO对高糖诱导HUVECs PDCD4表达的影响

图4 DIO对高糖诱导HUVECsPDCD4蛋白表达的影响

2.4抑制PDCD4对高糖诱导HUVECs增殖的影响 与对照组相比,高糖组的PDCD4、p21蛋白表达均明显增加,细胞活力明显降低(均P<0.05);与高糖+si-NC组相比,高糖+si-PDCD4组的PDCD4、p21蛋白表达均明显降低,细胞活力明显增加(均P<0.05),见图5、表4。

表4 抑制PDCD4对高糖诱导HUVECs增殖的影响

图5 抑制PDCD4对高糖诱导HUVECsPDCD4、p21蛋白表达的影响

2.5抑制PDCD4对高糖诱导HUVECs凋亡的影响 与对照组相比,高糖组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均明显增加,Bcl-2蛋白表达明显降低(均P<0.05);与高糖+si-NC相比,高糖+si-PDCD4组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均明显降低,Bcl-2蛋白表达明显增加(均P<0.05),见图6、表5。

表5 抑制PDCD4对高糖诱导HUVECs凋亡的影响

1～4:对照组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-PDCD4组

2.6过表达PDCD4可以逆转DIO对高糖诱导HUVECs增殖、凋亡的影响 与高糖组相比,高糖+DIO组PDCD4蛋白表达、细胞凋亡率、p21和Bax蛋白表达均明显降低,细胞活力、Bcl-2蛋白表达明显增加(均P<0.05);与高糖+DIO+pcDNA组相比,高糖+DIO+PDCD4组PDCD4蛋白表达、细胞凋亡率、p21和Bax蛋白表达均明显增加,细胞活力、Bcl-2蛋白表达明显降低(均P<0.05),见图7、表6。

表6 过表达PDCD4可以逆转DIO对高糖诱导HUVECs细胞增殖、凋亡的影响

1～4:高糖组、高糖+DIO组、高糖+DIO+pcDNA组、高糖+DIO+PDCD4组

3 讨 论

糖尿病受遗传、环境和饮食习惯等因素的影响,糖尿病引起的一系列糖尿病性周围血管病变系统疾病并发症严重威胁着人类的生命健康〔9,10〕。目前,中国糖尿病的患病率是世界上排行最高的,1990～2016年中国糖尿病患病率由3.7%上升至6.6%〔11〕。血管内皮细胞在细胞增殖和凋亡中处于一个动态平衡的状态,如果血管内皮细胞凋亡超过负荷,造成血管内皮细胞抗凝功能受阻,导致血管内皮细胞功能紊乱,是糖尿病血管疾病发病的主要原因〔12,13〕。DIO药用价值很高,广泛存在于薯蓣科、石竹科和百合科等植物中,在薯蓣科根茎中含量最高,具有消食利水、祛痰和舒筋活血等功效〔14〕。DIO在降低血糖方面效果作用明显,研究结果显示,DIO可以降低链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病血脂和氧化应激,提高促胰液素GLP-1释放〔15〕。吴贵福等〔16〕研究发现,DIO可以明显抑制高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞HUVEC凋亡和氧化损伤。本研究结果说明,DIO可以促进高糖诱导的HUVECs的增殖和抑制其细胞凋亡。

PDCD4在糖尿病性周围血管病变疾病、癌症中广泛表达,是一种促凋亡的基因,可以通过基因转录或翻译抑制疾病的生长和凋亡等过程〔17〕。郑华峰等〔18〕研究结果显示,miR-155通过调控PDCD4表达调控高糖诱导的血管内皮细胞的凋亡。在男性糖尿病并发症的研究中发现,PDCD4在高糖诱导的大鼠海绵体组织中高表达,下调PDCD4表达可以抑制海绵体平滑肌细胞凋亡和促进其细胞增殖〔19〕,这与本研究结果相似。Zhang等〔20〕研究结果显示,敲减PDCD4可以改善高糖诱导的糖尿病性周围血管病变大鼠的胰岛素抵抗和功能障碍,抑制心肌细胞的凋亡和炎症反应。敲低PDCD4可以明显促进高糖诱导的胰岛β细胞的增殖,抑制其细胞凋亡和氧化应激〔21〕,这与本研究结果相似。本研究结果说明PDCD4在糖尿病中发挥着重要的作用。DIO可以通过调控PDCD4影响高糖诱导的HUVECs增殖和凋亡。