双膦酸盐颌骨坏死的机制研究进展*

赵玲帆，叶鑫鑫，张强

对双膦酸盐的深入了解始于Fleisch 等对焦磷酸盐的研究，双膦酸盐是一种人工合成的焦磷酸盐类似物。近年来双膦酸盐类药物的使用变得越来越普遍，它是一种著名的抗吸收药物，在细胞水平起作用，针对破骨细胞并破坏其功能[1]。主要用于治疗骨转移癌、多发性骨髓瘤、骨质疏松症和成骨不全等疾病[2]。

最初认为双膦酸盐颌骨骨坏死是由于静脉注射高剂量的双膦酸盐来治疗转移性骨肿瘤或多发性骨髓瘤而发生的，然而最近的研究表明，BRONJ 也常发生在低剂量口服双膦酸盐来治疗骨质疏松症的患者中[3-4]。BRONJ 的临床症状各不相同，可无症状，也可出现局部疼痛、瘘管、溃疡、软组织炎症反应、牙齿松动、死骨暴露等症状。目前拔牙被认为是促进BRONJ的最主要的因素[5-6]，其他的危险因素还包括口腔种植体[7]、牙周病和根尖周病、可摘局部义齿和口内创伤，无骨组织损伤的单独软组织损伤也可以成为诱导BRONJ 的因素。最近更是有报道称双膦酸盐会引起种植体周围炎[8]。然而，关于这些促进因素的患病率和发病率的文献资料较少[9]，并且它们促进BRONJ 具体机制尚不明确，也没有有效的治疗及预防方法。在老龄化社会中，双膦酸盐等抗骨吸收药对于治疗骨质疏松是必不可少的，因此，BRONJ 是一个亟待解决的问题。我们回顾了其他学者的一些实验以及文献，总结了关于BRONJ 的几种主要机制，希望能促进BRONJ 机制研究的进一步发展，同时为治疗BRONJ 提供新的思路。

1 BRONJ 的发病机制

BRONJ 是长期大量应用双膦酸盐类(Bisphosphonates,BPs)药物治疗过程中出现的一种严重不良反应[10]。到目前为止，BRONJ 确切的发病机制尚不清楚，可能为多因素协同作用，包括正常骨转换率失衡、微血管栓塞、微生物感染、免疫功能障碍、基因多态性等，共同导致BRONJ 的发生。较为公认的假说有以下四个[11]：

1.1 BPs 破坏骨代谢过程中“吸收-重建”平衡正常骨组织中，破骨细胞行使骨吸收功能，与成骨细胞协同作用，在骨骼的形成和发育过程中具有重要意义。而长期服用双磷酸盐类药物的患者，BPs可以直接作用于破骨细胞，通过抑制破骨细胞3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶的活性，阻碍破骨细胞蛋白的异戊烯化，从而抑制破骨细胞引导的骨吸收[12]。而BPs 在抑制破骨细胞骨吸收功能的同时,也会影响成骨细胞的活性,扰乱了骨代谢过程中的“吸收-重建”平衡,造成颌骨骨修复不能正常进行,增加了颌骨坏死的风险。

1.2 BPs 对血管形成的影响作用 BPs 对血管形成的作用,主要表现为抑制内皮细胞增殖分化、黏附和迁移,诱导血管内皮细胞凋亡。BPs 这种对血管内皮细胞的抑制作用,使骨骼中的血供减少,骨组织改建减缓,从而造成了由局灶逐渐蔓延至较大范围的骨坏死。

1.3 微生物感染加重骨吸收 口腔内菌群纷繁复杂,接受双膦酸盐类药物治疗的患者在拔牙创伤、创伤性炎症、颌骨微循环障碍等因素共同作用下,颌骨抵抗力显著降低而易导致创口持续感染,进而发展为颌骨骨髓炎,并最终发生颌骨坏死[13]。

1.4 系统性免疫功能障碍 研究表明,BRONJ 发病机制可能与双膦酸盐类引起的全身性免疫功能障碍,进而增加口腔内微生物感染的易感性相关。

2 双膦酸盐类药物的分类

双膦酸盐根据其侧链的不同而分为含氮类（N-BPs）及非含氮类(non-N-BPs)两大类，双膦酸盐由一个中心碳原子连接到一个羟基，使双膦酸盐能与钙结合。碳原子两侧都有一个磷酸盐基团，使药物对羟基磷灰石的亲和力增加[14]。N-BPs主要包括帕米膦酸二钠、唑来膦酸、阿仑膦酸钠，non-N-BPs 主要有依替膦酸钠、氯屈膦酸钠。在抗骨吸收的效果上来说，N-BPs 的效果明显强于non-N-BPs。无论是N-BPs 还是non-N-BPs 均与骨羟基磷灰石有较强的结合能力，因此经过反复给药之后将会在骨组织中积累沉淀。而几乎所有的BRONJ 都是由N-BPs 引起的[15]，因而本综述探讨N-BPs 引起BRONJ 的主要机制。

3 N-BPs 与non-N-BPs 抗骨吸收的作用机制

N-BPs 与non-N-BPs 的抗骨吸收作用均是由于双膦酸盐在骨组织的吸收过程中进入破骨细胞，抑制破骨细胞的活性而产生的，但两者抑制破骨细胞的机制略有不同。N-BPs 在破骨细胞内能抑制法尼基焦磷酸合成酶，使法尼基焦磷酸的合成减少。法尼基焦磷酸合成的抑制不仅会降低胆固醇的合成，还会降低法尼醇、多萜醇、泛醌的合成。胆固醇是细胞膜不可缺少的成分，其合成途径一般存在于所有的真核细胞中，泛醌是细胞膜的稳定剂、抗氧化剂和线粒体呼吸链的组成成分，因此法尼基焦磷酸合成的抑制会对各种细胞产生细胞毒性，法尼基焦磷酸的减少还会导致低分子量G 蛋白的异戊烯化减少。从而减少了由这些蛋白介导的各种类型的信号传导，导致破骨细胞中一些必须蛋白质的合成受阻，影响破骨细胞活性和功能。此外，法尼基焦磷酸合成酶的抑制还会导致异戊烯焦磷酸的增加，异戊烯焦磷酸将会与磷酸腺苷结合并转化为细胞毒性分子，这就是目前N-BPs 在破骨细胞中公认的抗骨吸收作用的机制[16]。而non-N-BPs 在破骨细胞内与三磷酸腺苷竞争性结合为细胞毒性三磷酸腺苷类似物，同样可以抑制破骨细胞。

4 N-BPs 诱发组织的炎症及坏死反应

4.1 N-BPs 的炎症反应 第一次静脉注射N-BPs的患者中，约30%或者更多的患者出现发热。在接受静脉注射唑来膦酸治疗的儿童中，高达85%出现急性流感样反应，甚至有极少数情况会发生严重致命的病例。口服N-BPs 也有报道引起流感样症状，尽管发病率很低[17]。

实验发现，小鼠腹腔注射N-BPs 将会引起各种炎症反应，如脾脏肥大、胸腺萎缩、低血糖、腹水、胸水、腹腔内巨噬细胞和粒细胞的增加累积以及骨髓中红细胞生成减少等等。在预先接受N-BPs腹腔注射的小鼠中，细胞白介素1 明显增加，由脂多糖诱导产生的组氨酸脱羧酶同样也会增加[18-19]，在缺乏白介素1 的小鼠中，腹腔或局部注射N-BPs引起的炎症反应非常微弱。其中白介素1 是人体内常见的内源性致热因子，由两种常见类型，分别是白介素1α 和白介素1β。白介素1 以白介素1α 前体物质的形式存在于各种细胞中，当细胞受到损伤时释放[20]。白介素1β 的前体物质则只存在于部分细胞中，包括巨噬细胞、单核细胞和树突细胞[20]。

脂多糖是导致宿主牙周组织损害的最主要的微生物因子,脂多糖提供细菌相关的分子型,可以识别牙周组织中免疫和非免疫细胞的受体。Bando等[21]通过分析N-BPs(阿仑膦酸钠和唑来膦酸)对小鼠耳廓的炎症反应，发现阿仑膦酸钠和唑来膦酸（尤其是阿仑膦酸钠）均可引起早期弱耳肿胀和晚期强耳肿胀两个阶段，且N-BPs 和脂多糖之间的炎症作用相互增强，在脂多糖、阿仑膦酸钠或阿仑膦酸钠+脂多糖注射后第五天（耳肿胀几乎达到最大值），阿仑膦酸钠+脂多糖诱导的巨噬细胞、中性粒细胞、NK 细胞、T 细胞和B 细胞（但不包含嗜酸性粒细胞）的积累比脂多糖或阿仑膦酸钠单独诱导的要多。总之，阿仑膦酸钠+脂多糖可以提高白介素1β、白介素18 以及肿瘤坏死因子α水平，通过巨噬细胞和中性粒细胞增强耳肿胀。

以上均能说明N-BPs能诱发组织的炎症反应。

4.2 N-BPs 的坏死效应 如前所述，将N-BPs 注射到小鼠的耳廓时，会在注射部位产生炎性肿胀，当注射高浓度的N-BPs 时会导致坏死。低浓度的N-BPs 引起的肿胀在缺乏白介素1 的小鼠中比野生型的小鼠要小得多，但是高浓度的N-BPs 在两种小鼠中引起的坏死程度相似[22]，这说明白介素1 参与了N-BPs 引起的炎症坏死，并有可能还有其他的细胞毒性因子也在N-BPs 引起的坏死中起重要作用。

临床上，本病大多数患者发展缓慢,初期以颌骨坏死部位间歇性钝痛或持续性针刺样疼痛为首要表现,进一步发展出现牙齿疼痛、松动,如未及时治疗则破溃流脓,经久不愈,多并发细菌感染而伴有口臭,严重影响患者的生活质量。部分患者表现为拔牙创不愈或牙龈自发破损,并时常伴有炎性分泌物,色黄,味臭[23-24]。在此阶段通常看不到影像学上的颌骨改变,进一步发展,拔牙创或黏膜破损处出现大面积溃烂,黏膜下的骨面暴露,颌骨逐渐加剧疼痛,并最终导致广泛的骨面暴露,随着病程的不断恶化,死骨最终形成[25]。BRONJ 的病理学表现为:坏死的颌骨外观上多孔、质轻,呈虫蚀样或浮石粉状,组织学上可见病变骨破骨细胞减少、Howship 陷窝缺失、中性粒细胞和淋巴细胞浸润，多合并放线菌感染,但放线菌在发病机制中的作用仍不完全清楚。

5 感染与N-BPs 炎症坏死作用相互促进

如前所述，经过N-BPs 预处理的小鼠，脂多糖诱导组氨酸脱羧酶的能力增强，白介素1 表达量也增加。此外，在用脂多糖预处理的小鼠中，N-BPs 诱导组氨酸脱羧酶的能力也会增强。中间普氏菌是牙周炎中常见的革兰氏阴性菌，在经过N-BPs 预处理的小鼠中，中间普氏菌的脂多糖所介导的炎症反应也更为严重[26]。在口腔细菌环境下，N-BPs 能使巨噬细胞体外释放白介素1 增加[27]。许多临床研究表明，牙周或根尖周感染会促使大多数牙齿拔除，并增加颌骨坏死的风险[28]。一些研究人员报告了结合了这些口腔风险因素的体内大鼠模型[29-31]，首先诱发炎症性牙病（如牙周炎、根尖周感染等），然后拔除受感染的牙齿。大多数研究将唑来膦酸作为全身危险因素。事实上，与拔牙未感染组相比，拔牙感染组大鼠牙槽骨坏死、拔牙窝愈合不良和持续炎症反应更明显。且有报道称，接受肿瘤剂量的唑来膦酸治疗的局限性牙周炎大鼠的BRONJ 患病率显著低于未接受牙周清洁的局限性牙周炎大鼠[32]。这些发现表明了炎症促进N-BPs 引起的坏死作用。

白细胞介素1b、白细胞介素6 和肿瘤坏死因子α 是重要的炎性细胞因子；一氧化氮是一氧化氮合成酶产生的炎症指数。一项细胞实验[33]发现，在RAW264.7 细胞用唑来膦酸（10mM）预处理24小时，然后用脂多糖（100 ng/mL）孵育0、1、2、4 或6 小时后。发现唑来膦酸处理后，脂多糖刺激RAW264.7 细胞产生的白细胞介素1b、白细胞介素6 和肿瘤坏死因子α 显著增加；唑来膦酸加速一氧化氮释放。这表明了N-PBs 对炎症的促进作用。

以上均表明，N-BPs 的炎症坏死作用与感染导致的炎症反应能够相互促进，可能成为BRONJ的致病机制之一。

6 N-BPs 进入软组织细胞的机制

N-BPs 与羟基磷灰石结合，当破骨细胞吸收骨组织时会释放盐酸，以溶解骨组织，导致先前积累在骨组织中的双膦酸盐释放出来，双膦酸盐处于被破骨细胞覆盖的骨组织表面，极性较低，质子与双膦酸盐的两个膦酸残基结合，使其具有亲脂性，此时双膦酸盐可以通过被动和非特异性转运的方式进入破骨细胞。当处于中性环境时，双膦酸盐由于失去质子而高度极化，使得它们很难通过细胞膜。因此在中性软组织环境中，N-BPs必须通过某些特定的转运体进入细胞，抑制这种转运体有望减少或者防止N-BPs的炎症坏死作用。目前已知的三种磷酸盐转运蛋白分别是溶质载体17、溶质载体20 和溶质载体34[34]，其中溶质载体20 广泛分布于各种细胞中。N-BPs 通过溶质载体20 和溶质载体34 进入细胞，而依替膦酸钠和氯屈膦酸钠能抑制磷酸盐转运蛋白[35]从而减少或防止N-BPs 的炎症坏死作用。

7 与颌骨坏死（OBJ）有关的其他的药物

药物引起的颌骨骨坏死最早由Marx 报道，他注意到，36 例患者接受帕米膦酸二钠和唑来膦酸治疗后，上颌骨、下颌骨或者两者都出现疼痛并伴有骨暴露。越来越多的研究已经确定颌骨骨坏死是由抗骨吸收药物引起的，包括[36-38]地诺单抗，核因子kappa-B 配体抑制剂的受体激活剂;抗血管生成药物，如贝伐珠单抗;以及酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼和索拉非尼。因此，2014 年美国口腔颌面外科医师协会提出将与药物相关的颌骨骨坏死命名为药物相关性颌骨骨坏死(drug-related osteonecsis of the jaw,MRONJ)，以区别于BRONJ。

8 BRONJ 的预防及治疗策略

8.1 预防策略 近来有报道称，拔牙和外科手术的正确操作也可以有效预防BRONJ，甚至在高危患者中也可以发挥作用。Alonso-rodriguez 等[39]应用可吸收止血明胶海绵负载脂肪干细胞填塞拔牙窝，同时颊黏膜骨膜瓣覆盖预防BRONJ；Zang等[40]利用脂肪干细胞结合羟基磷灰石填塞拔牙术后牙槽窝预防兔BRONJ。如前所述，感染是促进BRONJ 的关键因素，因此在有创口腔治疗前，应严格控制感染，可以降低发生BRONJ 的风险。

8.2 治疗方法 目前除了抗生素、镇痛药和常规手术治疗外，还有其他几种治疗BRONJ 的方法：荧光引导下的坏死骨切除术[41]，粘骨膜瓣和局部带蒂颊脂垫的皮瓣修复[42]，臭氧/氧气疗法[43]，拔牙后低强度的激光治疗，特立帕肽治疗[44]以及富含血小板血浆[45]在边缘骨切除术后的应用，这些治疗方法均为病例报告，尚未得到证实。其中，将特立帕肽作为替代药物治疗由低剂量双膦酸盐引起的BRONJ 具有明显治疗的效果[46]，但是特立帕肽必须皮下注射(不能口服)，且不能用于骨转移性癌症的BRONJ 患者(因为其致瘤性使其成为此类患者的禁忌症)。富含血小板血浆治疗的疗效也被反复报道，富含血小板血浆中含有促进组织血管化的多种生长因子的存在，可以改善BRONJ中缺乏血管化的问题，从而促进组织愈合[47]，有效缓解BRONJ 的发生[48]但其缺点是必须使用患者自体的血浆。Khosla 等通过研究发现,双膦酸盐可引起血管内皮生长因子、成纤维生长因子等暂时性减少。Stresing 等研究发现,N-BPs 可通过甲羟戊酸合成途径抑制血管发生,血管改建受抑制可能引起骨改建受抑制,这也可能是颌骨坏死发生的原因，故手术时应去除无血坏死组织，直至见到“出血”为止，降低BRONJ 的发生。

除此之外，还可以将non-N-BPs 作为N-BPs的替代药物或non-N-BPs 与N-BPs 联合用药。实验证明，non-N-BPs 可以减轻N-BPs 的局部或者全身的炎症坏死作用[49]，并且non-N-BPs 中的氯屈膦酸钠通过抑制磷酸盐转运体而抑制N-BPs 进入细胞，并抑制或阻止N-BPs 的炎症坏死作用。而氯屈膦酸钠对骨的亲和力弱于N-BPs，因此其竞争性抑制N-BPs 与骨结合的能力也较弱，因此可以尝试运用氯屈膦酸钠联合N-BPs 用药来预防N-BPs的炎症坏死作用，并且不会削弱N-BPs 强大的抗骨吸收作用。但是氯屈膦酸钠不能去除已经积累在骨骼中的N-BPs，因为它对骨组织的亲和力较低。由于氯屈膦酸钠的抗骨吸收活性是依替膦酸钠的3倍以上，因此与N-BPs 联合用药也许是一种较为稳妥的预防以及治疗方式。

9 结 论

目前在各种各样的抗骨吸收药物中，N-BPs仍然是首选药物。但是N-BPs 口服后生物利用率非常低，因此在临床上多用于静脉注射治疗。BRONJ 多出现于静脉注射含氮BPs 药物的患者，因此推测出N-BPs 可能的潜在致病机制为：N-BPs通过反复给药在下颌骨内积累,拔牙及口内的细菌环境能促进因N-BPs 积累而引起的炎症。感染或拔牙等导致的骨组织的破坏将骨中积累的N-BPs释放到周围的组织，即使是死亡的破骨细胞同样可以释放N-BPs。N-BPs 通过磷酸盐转运体进入下颌骨周围的软组织中，N-BPs 的细胞毒性引起炎症和细胞死亡。这些作用将引起一个恶性循环，最终可能导致下颌骨的坏死以及死骨的外露。由于依替膦酸钠以及氯屈膦酸钠可以抑制磷酸盐转运体，或许依替膦酸钠和氯屈膦酸钠可以作为N-BPs 的替代药物或联合用药在治疗BRONJ 中得到应用。