一株乳酸菌和酵母菌共培养方法的初探

刘少杰，张金朝，王宇，王晓茹⋆

（1.诺达生物科技（赞皇）有限公司，河北石家庄 051230；2.石家庄学院，河北石家庄 050000）

随着饲用微生态制剂无毒害、绿色、成本低、无耐药性等优点的突显，现如今已成为养殖业的新星与研究热点。混合微生物制剂是将乳酸菌、酵母菌等益生菌复配在一起而使得混合微生物制剂功效得以提高，混合微生物制剂越来越多的应用于畜牧养业殖中。

为让乳酸菌和酵母菌共培养时达到最佳生长状态，本试验先用同一培养基对两株菌同时优化，以便为后续两株菌种的共培养提供条件基础。再分别对乳酸菌和酵母菌在培养时间、转速、初始pH 值、培养温度等培养条件进行优化，找出最适生长条件，最后在共培养阶段对接种量进行探索，以期为乳酸菌和酵母菌复配的混合微生物制剂的进一步研究与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

乳酸菌、酵母菌由石家庄学院河北省高校微生物制药应用技术研发中心惠赠。

1.1.2 试剂

葡萄糖、硫酸锰、碳酸钙、蛋白胨、硫酸镁、牛肉膏、磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、酵母膏、酵母浸粉、糖蜜、乙酸钠。

1.1.3 培养基配方

YPD 培养基：酵母膏10 克/升、葡萄糖20克/升、蛋白胨20 克/升。固体需加1%琼脂粉。

MRS 培养基：牛肉膏8 克/升、葡萄糖20 克/升、蛋白胨10 克/升、酵母浸粉4 克/升、磷酸二氢钾2 克/升、柠檬酸三铵2 克/升、乙酸钠5 克/升、硫酸镁0.2 克/升、硫酸锰0.05 克/升、吐温80 1 毫升/升。固体需加1%琼脂粉。

改良MRS 培养基：糖蜜28 克/升、酵母浸粉（工业用）14 克/升、磷酸二氢钾2 克/升、柠檬酸三铵2 克/升、乙酸钠5 克/升、硫酸镁0.2 克/升、硫酸锰0.05 克/升、吐温80 1 毫升/升。固体需加1%琼脂粉。

培养基121℃高压灭菌20 分钟备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的复苏与活化

在超净工作台中吸取10 微升冻存的乳酸菌，接种于1 毫升MRS 液体培养基中，37℃摇床培养24 小时。无菌接种环蘸取菌液，在MRS 平板上划线，37℃培养48 小时，待长出单菌落后，挑单菌落接种于MRS 液体培养基中活化备用。

酵母菌以同样方法用YPD 培养基复苏活化。

1.2.2 培养基的优化

将活化好的乳酸菌和酵母菌分别按1%接种量接种到原培养基和改良MRS 培养基中，37℃72 小时后，紫外分光光度计测得在600 纳米处的吸光值并镜检观察，确定在改良MRS 液体培养基中乳酸菌和酵母菌能否生长良好。

1.2.3 初始pH 值的确定

分别取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接种量接种于pH 值调到4、5、6、7、8 的灭菌改良MRS 培养基中，恒温培养72 小时后测定吸光值。

1.2.4 培养温度的确定

分别取活化后的乳酸菌和酵母菌按1%接种量接种于灭菌改良MRS 培养基中，设置不同温度恒温培养箱：28℃、30℃、37℃，其他培养条件相同，恒温培养培养72 小时后测定吸光值。

1.2.5 转速的确定

分别取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接种量接种于灭菌改良MRS 培养基中，分别于转速为0、50、100 和200 转每分钟条件下恒温培养72 小时后测定吸光值。

1.2.6 培养时间的确定

分别取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接种量接种于灭菌改良MRS 培养基中，培养24 小时、36 小时、48 小时、72 小时，随后测定菌液吸光值，以得出最佳培养时间。

1.3 菌种接种方式的确定

1.3.1 乳酸菌和酵母菌分时接种

将活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接种量，在最适培养条件下进行接种。先接种酵母菌，培养48 小时后接种乳酸菌，于最适培养条件下再培养48 小时，测定吸光值。

将活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接种量，在最适培养条件下进行接种。先接种乳酸菌，培养48 小时后接种酵母菌，于最适培养条件下再培养48 小时，测定吸光值。

1.3.2 乳酸菌和酵母菌同时接种

将活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接种量，在最适培养条件下进行接种。同时接种酵母菌和乳酸菌，培养48 小时，测定吸光值。

2 试验结果

2.1 镜检形态

由乳酸菌镜检图，可见短杆形或近球形且呈链状排列的形态；由酵母菌镜检图，可见大多为球型均匀分布的形态；由乳酸菌和酵母菌共培养时的菌株形态，可看到乳酸菌和酵母菌均匀分布于视野中。

2.2 培养基的优化

各菌株在原培养基和改良MRS 培养基中的培养菌液吸光值差异不太明显，因改良MRS 培养基适用于工业生产且更价廉，所以改良后的培养基吸光值稍低，仍可以用改良MRS 作为基础培基来培养乳酸菌和酵母菌。

2.3 初始pH 值的确定

乳酸菌和酵母菌在pH＜6 时，菌液浓度一直呈上升趋势，而当pH＞6 时，菌液浓度呈现下降趋势，由此我们可以初步确定乳酸菌和酵母菌的最适pH 为6.0。

2.4 温度的确定

乳酸菌吸光值随温度升高而变大，在28℃时吸光值最高；酵母菌吸光值随温度升高而降低，在37℃时吸光值最高。两曲线交于36℃处，二者共培养时的最适温度为36℃。

2.5 转速的确定

乳酸菌吸光值在转速0～100 转时逐渐降低，转速为0 吸光值最大，大于100 转时又有上升趋势；酵母菌吸光值在转速为0～100 转时很低，从转速为100 转时吸光值直线升高，在转速为200 转时吸光值最大。两曲线相交于144 转，因此二者共培养时的最适转速为144 转每分钟。

2.6 培养时间的确定

乳酸菌培养时间在48 小时前，菌液浓度一直呈上升趋势，而当48 小时后，菌液浓度呈现下降趋势，因此判定乳酸菌最佳培养时间为48小时；酵母菌随培养时间的延长而菌量变大，因此共培养时的最佳培养时间为48 小时。

2.7 接种顺序的确定

先接种乳酸菌，再接种酵母菌这种接种方式吸光值最高，即培养的菌浓最高，为接种方式的最佳选择。

3 结论

本试验研究表明改良MRS 培养基更适合于乳酸菌和酵母菌的工业生产，其中用于培养乳酸菌的最适培养条件为初始pH 值6.0，温度37℃，培养时间48 小时，转速为0，用于培养酵母菌的最适培养条件为初始pH 值6.0，温度28℃，培养时间为72 小时，转速200 转每分钟。乳酸菌和酵母菌共同培养时最佳培养条件为初始pH 值6.0，温度36℃，培养时间为48 小时，转速为144 转每分钟；乳酸菌和酵母菌共培养时接种方式的最佳选择为先接种乳酸菌，再接种酵母菌。