1例自身抗LW的血清学鉴定及基因分析

黄娴,吴丽娜,李彤彤,解金辉(天津市血液中心免疫血液学研究室,天津 300110)

Landsteiner-Wiener(LW)血型系统(ISBT016)包括3个抗原:LWa、LWb、LWab,均由细胞间黏附分子4(intercellular adhesion molecule 4,ICAM4)基因编码。LWa和LWab为高频抗原[1],LWb为低频抗原,LWa和LWb是对偶抗原。LWa/LWb抗原多态性的分子基础是299A>G单核苷酸多态性导致LW糖蛋白Gln100Arg氨基酸的替换[2]。虽然LW与RhD是不同的抗原,但对成人而言,LW表达量与RhD表达量呈正相关,成人RhD阴性红细胞的LW抗原表达少,因此抗LW 常被误认为抗D。但新生儿红细胞上LW强表达[3],新生儿RhD阳性、阴性红细胞与抗LW反应均比成人红细胞强,可以通过相关试验加以区分。本实验室鉴定1例自身抗LW并进行基因测序,报告如下。

1 材料和方法

1.1标本来源 患者,女,89岁,孕1产1,2004年因乳腺手术输血,2022年入院诊断为淋巴瘤,血红蛋白37 g/L,需输注红细胞,医院因不规则抗体筛查阳性送检血液样本至天津市血液中心进行抗体鉴定和交叉配血。

1.2主要试剂与仪器 单克隆抗A、抗B及反定型ABO红细胞(上海血液生物制品公司),IgM抗D、不规则抗体筛选红细胞、16系谱细胞(荷兰Sanquin公司),微柱凝胶卡(美国Bio-Rad公司),Rh分型试剂(德国CE公司),酸放散试剂(珠海贝索公司),DNA提取试剂盒(广州美基生物公司),Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)。所有试剂均在有效期内使用。孵育器、卡式离心机(美国Bio-Rad公司),离心机(日本KUBOTA公司),分光光度计(德国Implen公司),PCR仪(美国AB公司),电泳仪(美国Thermo Fisher公司),凝胶成像仪(北京东讯天地公司)。

1.3血清学检测

1.3.1血型和直接抗球蛋白试验 采用试管法对进行ABO、Rh分型,采用多抗卡进行直接抗球蛋白试验,由于试剂限制未进行直接抗球蛋白分型。

1.3.2不规则抗体筛查与鉴定 采用盐水法、微柱凝胶卡,结合木瓜酶处理、0.2 mol/L DTT处理细胞,参照《全国临床检验操作规程》、《AABB技术手册(第20版)》和试剂说明书操作。

1.3.3与新生儿红细胞反应 因未取得脐血,使用出生2 d的新生儿红细胞,据报道新生儿RhD阴性红细胞上的LW抗原数量多于成人[3]。为排除D变异型和Del干扰,本研究使用的所有RhD阴性成人红细胞、新生儿红细胞均使用3种不同厂家试剂确认,且Rh分型均为ccdee。

1.3.4吸收放散试验 患者自身细胞放散:取患者压积红细胞,洗涤5次,按照试剂盒说明书进行酸放散。新生儿RhD阴性红细胞吸收患者血清后放散:取O型、RhD阴性的新生儿压积红细胞与患者等体积的血清混匀,37 ℃温育60 min,其间数次混匀使其充分吸收。离心后弃上清液, 洗涤5次,按照试剂盒说明书酸放散。用木瓜酶处理前后的O型RhD阳性、阴性成人红细胞与放散液反应,采用微柱凝胶卡检测。

1.3.5交叉配血试验 患者血清与6份AB型RhD阳性红细胞、2份AB型RhD阴性红细胞,采用盐水法、微柱凝胶卡、试管抗人球蛋白法进行主次侧交叉配血。

1.4ICAM4基因测序 按照试剂盒说明书提取外周血基因组DNA。扩增和测序引物使用NCBI网站的Primer-BLAST程序设计,由Invitrogen公司合成,序列见表1。PCR扩增反应总体积为50 μL,含模板DNA 1 μL,正向引物LWF(10 μmol/μL)2 μL,反向引物LWR(10 μmol/μL)2 μL,dNTP 4 μL, 10×PCR Buffer 5 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.6 μL。扩增程序:96 ℃预变性8 min;95 ℃ 20 s,75 ℃ 40 s,10个循环;95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 延伸5 min。PCR反应结束后,取5 μL PCR产物,经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶电泳成像系统观察并鉴定产物的特异性。扩增产物纯化后委托上海生工生物工程公司测序。序列比对和分析使用DNAMAN 软件进行,与GenBank中的NG_007728.1序列比对,确定标本的LW基因型。

2 结果

2.1血型和直接抗球蛋白试验 患者血型为AB,CCDee。直接抗球蛋白试验阳性2+s。

2.2抗体筛查 患者血清在盐水介质中抗筛阴性,在微柱凝胶卡中与RhD阳性的1、2号细胞凝集强度2+,与RhD阴性的3号细胞弱凝集w+,木瓜酶处理后凝集有所增强,0.2 mol/L DTT处理后均阴性,提示抗体对应的抗原可能被DTT破坏。

2.3抗体鉴定 谱细胞结果显示患者血清中的抗体呈抗D格局,在微柱凝胶卡中与RhD阳性的细胞凝集强度2+,与RhD阴性的细胞弱凝集w+。结合抗体筛查试验0.2 mol/L DTT可破坏抗原抗体反应,疑似抗LW抗体。

2.4与新生儿红细胞反应 结果见表2,患者血清与新生儿RhD阳性、阴性红细胞反应凝集强度均强于成人RhD阴性红细胞。

表2 患者血清与新生儿红细胞反应结果

2.5吸收放散试验 自身细胞放散液、新生儿RhD阴性红细胞吸收患者血清后放散液,均与酶处理成人RhD阳性红细胞反应强于RhD阴性红细胞,且新生儿RhD阴性红细胞吸收患者血清后放散液反应略强于自身细胞放散液。说明患者血清中的抗体可被新生儿RhD阴性红细胞吸收,符合抗LW抗体特征,不同于抗D。

2.6交叉配血及输血 患者血清与6份AB型RhD阳性红细胞反应,主侧盐水法均阴性,微柱凝胶卡和试管抗人球法均阳性2+,与2份AB型RhD阴性红细胞反应主侧盐水法均阴性,微柱凝胶卡和试管抗人球法均呈弱阳性w+。为缓解患者贫血状况,1周内给予3次AB型RhD阴性红细胞进行输注,3次输注后,患者血红蛋白由37 g/L升至70 g/L,未发现输血不良反应。

2.7ICAM4基因测序结果 将标本外显子1、2、3的测序结果与参考序列对比,结果显示第299位核苷酸为A纯合子(图1),该患者LW血型基因型为LWa/LWa。外显子1～3其他位点与参比序列完全一致,未发现基因突变。

图1 LW基因外显子部分序列

3 讨论

LW糖蛋白是细胞间黏附分子,也可与Rh蛋白、带3蛋白在红细胞膜上形成复合物。抗LW的谱细胞格局与抗D类似,抗体鉴定时可采取相关试验予以区分:(1)DTT能破坏LW抗原肽链上的3个二硫键从而破坏LW抗原,但不能破坏D抗原[4]。(2)RhD阴性的成人红细胞不含D 抗原,但含有少量LW抗原。(3)与成人红细胞不同,RhD阳性和RhD阴性的新生儿红细胞及脐血,均含有较多的LW抗原。有文献报道RhD阴性的成人红细胞可吸收抗LW[5],本研究采用新生儿RhD阴性的红细胞吸收,与成人RhD阴性红细胞相比,新生儿RhD阴性红细胞LW抗原量更多,吸收效果更好。可将放散液与新生儿红细胞反应,凝集应更强。(4)据报道,LW抗原不会被木瓜酶、无花果酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶破坏,但可被链酶蛋白酶破坏[6]。本实验结果显示木瓜酶对反应有所增强,与文献[7]结果相符,有条件时可采用链酶蛋白酶处理。另外,由于本研究采用测序方法检测患者LW基因型为LWa/LWa,推测患者LW血型为常见的LW(a+b-),不是产生同种抗LW的LW(a-b-)血型。进一步佐证本例抗LW为自身抗体,而非同种抗体。

抗LW在自身免疫性溶血性贫血患者体内常见,绝大多数为自身抗体,多为IgG抗体,通常认为临床意义不大,仅有1例报道自身抗LW引起新生儿溶血症[8]。对于含有抗LW的自身免疫性溶血性贫血,有长期体内红细胞存活研究和案例显示[9-10],选择RhD 阴性红细胞安全有效;也有文献[5]报道RhD阴性血稀缺时可筛选凝集最弱的RhD阳性红细胞输注。本例患者确诊淋巴瘤,直接抗球蛋白试验阳性,其自身抗体具有特异性,与RhD阳性红细胞主侧凝集均较强,选择含有较少LW抗原的RhD阴性红细胞可以降低抗LW抗体对红细胞可能造成的破坏,临床反馈输注有效。