人单核细胞株巨细胞病毒编码miR-US25-1-3p过表达后蛋白质组学变化分析*

周万青,王成,丁小宇,牛冬梅,沈瀚,张春妮(.南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,南京0008;.南京大学医学院附属金陵医院检验科,南京000;.南京中医药大学附属南京中医院检验科, 南京 00)

蛋白质组学(proteomics)在微小核糖核酸(miRNA)调控细胞靶蛋白的鉴定和量化研究中具有重要价值[1-2]。人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在人群中感染率极高,对于免疫受损人群危害极大,其参与疾病发生发展的病理功能尚不完全清楚,HCMV编码miRNA可能发挥重要作用。单核细胞是HCMV主要感染和潜伏细胞,在病毒感染免疫中发挥多种功能[3]。基于人单核细胞细胞株(THP-1)为模型细胞,对miRNA作用蛋白靶点的研究目前已有报道,如miR-618通过下调THP-1细胞环腺苷酸调节的磷酸化蛋白-19表达抑制细胞增殖、促进细胞凋亡[4];miR-203a-3p可靶向抑制THP-1中IL-24表达,发挥抗炎作用[5]。同时,THP-1细胞也是HCMV编码miRNA功能研究重要细胞载体[3]。本课题组前期研究发现,在HCMV激活感染人群外周血中有较高水平hcmv-miR-US25-1-3p表达[6],提示其可能在病毒感染过程中发挥重要作用,但其作用靶点不明确。目前,利用蛋白质组学技术分析HCMV miRNA作用单核细胞后蛋白质表达谱的研究尚未见报道。因此,本研究采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记联合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对hcmv-miR-US25-1-3p过表达THP-1细胞进行蛋白质组学分析,通过生物信息学分析潜在靶基因及其参与炎症、疾病及信号转导等方面功能。

1 材料与方法

1.1细胞株 THP-1人单核细胞株购自上海生物科学院细胞所。

1.2主要仪器与试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司),T100梯度PCR仪、Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统、Power Supplies Basic电泳仪(美国Bio-Rad公司),RIGOL L-3000高效液相色谱系统(北京普源精电科技公司),CV100真空离心浓缩仪(北京吉艾母科技公司),Q Exactive HF-X质谱仪(美国Thermo Scientific公司),G:BOXChemiXR5凝胶成像系统(英国Syngene公司),JY96-IIN超声破碎仪(上海沪析实业公司);Trizol、Lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司),cDNA第一链合成试剂盒、One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(SYBR Green)(大连TaKaRa公司),引物合成、mimics合成(广州锐博生物科技公司),胎牛血清、DMEM高糖培养基(美国Gibco公司),TRAIL抗体、RANTES抗体、GAPDH单克隆抗体、羊抗兔IgG-HR、羊抗小鼠IgG-HRP(武汉Proteintech公司),全蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、western blot检测试剂盒及相关试剂(上海碧云天生物技术公司);碘代乙酰胺(IAM)、尿素(美国Amresco公司),XBridge Peptide BEH 5 μm C18色谱柱(美国Waters公司),佛波酯(PMA)、甲酸(FA)(美国Sigma-Aldrich公司),TMT 10 plexTMIsobaric Label Reagent Set、牛血清白蛋白(美国Thermo Scientific公司),乙腈(美国J.T.Baker公司),氨水(日本Wako Pure Chemical Industries公司),胰蛋白酶(美国Promega公司),常规化学试剂(南京化学试剂公司)。

1.3hcmv-miR-US25-1-3p转染THP-1细胞 人THP-1细胞置于DMEM高糖培养基(含10% FBS和1%青霉素/链霉素)中37 ℃、5% CO2培养至细胞密度达70%～80%时,采用10 ng/mL浓度PMA刺激24 h;PBS洗涤并更换培养液。用120 μL不含血清培养基Opti-MEM稀释5 μL 20 μmol/L miRNA mimics、NC-mimics及空白对照,轻轻混匀,室温孵育5 min;用120 μL不含血清培养基Opti-MEM稀释5 μL Lipofectamine 3000,轻轻混匀并室温孵育5 min;将上述2种稀释液轻轻混匀,室温孵育20 min;加入含有750 μL完全培养基的上述培养细胞孔中,轻轻混匀,置37 ℃ 5% CO2培养48 h;收集细胞,用于后续实验。

1.4实时荧光定量逆转录PCR检测hcmv-miR-US25-1-3p水平 采用Trizol提取细胞总RNA,并经浓度和纯度测定。采用cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA,按照RT-PCR Kit Ⅱ试剂说明书进行PCR扩增。引物序列见表1。PCR反应体系为20 μL:DEPC水7 μL、2 × Real time PCR Master Mix(SYBR Green)10 μL、Primer MIX(10 μmol/L)2 μL、cDNA 1 μL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 40 s,40个循环。每个样本设3个重复。通过仪器配套的分析软件对测定结果设定统一的阈值,分析获得检测的Cq值,采用相对定量2-ΔΔCq法进行数据分析,其中ΔΔCq=(CqmiRNA-CqGAPDH)实验-(CqmiRNA-CqGAPDH)对照。

表1 本研究中所用引物序列

1.5细胞蛋白提取、酶解脱盐及标记 按照1.3方法收集转染后细胞并经预冷PBS洗涤3次。置冰上(8 mol/L尿素,裂解液与蛋白酶抑制剂体积比为50∶1)超声裂解120 s;4 ℃、14 000×g离心20 min,收集上清液。取100 μg蛋白质,加入DTT至终浓度为10 mmol/L,37 ℃ 1 h,恢复室温;加入IAM至终浓度为40 mmol/L,避光室温反应45 min;调节pH=8,按照蛋白质和胰蛋白酶体积比50∶1加入胰蛋白酶,37 ℃过夜;次日,加入50 μL 0.1% FA终止反应;样本经XBridge Peptide BEH 5 μm C18柱子分离,收集流穿液并冻干。取出TMT试剂并解冻,加入41 μL乙腈,震荡5 min,离心;将上述TMT试剂加入100 μg酶切样本中,室温1 h;加入氨水终止反应;混合标记后的样品,涡旋震荡,离心至管底;真空冷冻离心干燥。

1.6LC-MS/MS分析 使用10 μL A液(100%质谱水、0.1%甲酸)溶解冻干粉末,4 ℃、14 000×g离心20 min;取1 μg上清液样品进样,液质检测;使用Q Exactive HF-X质谱仪,Nanospray FlexTM(NSI)离子源,设定离子喷雾电压为2.4 kV,离子传输管温度为275 ℃,质谱采用数据依赖型采集模式,质谱全扫描范围为407～1 550 m/z,一级质谱分辨率设为60 000(200 m/z),自动增益控制(automatic gain control, AGC)为3×106,C-trap最大注入时间为20 ms;选取全扫描中离子强度TOP40的母离子使用高能碰撞裂解方法碎裂,进行二级质谱检测,二级质谱分辨率设为45 000(200 m/z),AGC为5×104,最大注入时间为86 ms,肽段碎裂碰撞能量设为32%,生成质谱检测原始数据。

1.7数据处理及蛋白质注释 采用Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.4软件搜索Uniprot_ Pseudomonas syringae pv.tomato(2020.04.22 download)数据库,对鉴定出的蛋白质进行GO[7]、KEGG[8]和COG[9]注释分析。将每个蛋白质的两个比较样品对中的相对定量值进行t检验,统计差异性。以差异倍数(FC)≥1.20,同时P≤0.05时,筛选上调表达蛋白质;以FC≤1/1.20,同时P≤0.05时,筛选下调表达蛋白质。对鉴定出差异表达蛋白质(different expression protein,DEP)进行GO、KEGG和COG注释分析。

1.8western blot 按照1.3方法收集转染后细胞,冷PBS洗2次;加入细胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl,150 mmol/L NaCl,0.02% NaN3,1% NP-40,适量蛋白酶抑制剂)提取细胞总蛋白。经BCA法测定总蛋白浓度后取50 μg总蛋白进行western blot分析。样品电泳分离后,蛋白质条带电转移至PVDF膜上,1∶1 000稀释一抗(兔抗人TRAIL、RANTES、兔抗人GAPDH抗体)孵育过夜;次日,按1∶2 000稀释二抗反应1.5 h。用TBST清洗条带后加入荧光底物,采用G:BOXChemiXR5成像,并使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

2 结果

2.1hcmv-miR-US25-1-3p转染效率 THP-1细胞转染hcmv-miR-US25-1-3p mimics、NC mimics后,提取细胞总RNA,并经RT-qPCR检测各组hcmv-miR-US25-1-3p水平。结果显示,hcmv-miR-US25-1-3p mimics组表达水平达138.72±5.85,高于NC组(1.1±0.05)和control组(1.00±0.06),差异有统计学意义(P<0.001)。表明hcmv-miR-US25-1-3p过表达THP-1细胞模型构建成功。

2.2蛋白质组基本信息 转染hcmv-miR-US25-1-3p mimics为实验组,转染NC mimics为对照组,每组3个样本。两组样本主成分分析(PCA)显示,两组间的总体差异性显著,而组内3个样本间变异度较小,见图1A。共鉴定3 254个蛋白质,经过COG、KEGG和GO生物学重复和结果重叠,共有3 239个蛋白质被量化。将3个注释结果集合分析,见图1B。

注:A,两组样本主成分分析(PCA);B,蛋白质功能注释结果统计Venn图;nc,阴性对照无义序列RNA mimics组;mim,hcmv-miR-US-25-1-3p mimics组。

2.3差异表达蛋白筛选及聚类分析 利用t检验分析两样本间显著差异表达的蛋白质,筛选出差异蛋白65个,其中上调蛋白质17个,下调蛋白质48个,见表2。以两组样本FC求取log2对数为横坐标,以t检验显著性检验P值的负对数-log2(Pvalue)为纵坐标,采用软件ggplot2,以FC阈值≥1.20或者≤1/1.20、P≤0.05,可得火山图,见图2A。采用heatmap.3和RColorBrewer软件,绘制差异蛋白热图。可见,差异表达蛋白聚类可明确区分两组样本,见图2B。

注:A,差异蛋白火山图;B,差异蛋白聚类图;红色代表上调差异表达蛋白质;绿色代表下调差异表达蛋白质;黑色代表未有显著变化蛋白质。

表2 差异表达蛋白定量结果

2.4差异蛋白功能注释及富集分析 GO注释分析显示,差异蛋白参与抗病毒作用、免疫反应、趋化因子和细胞因子介导信号通路、Ⅰ型干扰素反应、NF-κB信号通路;具有细胞因子活性、趋化因子活性、清道夫受体活性、抗原结合、锰离子结合、蛋白质同构化活性等。KEGG通路分析显示,差异表达蛋白主要参与炎症反应中各种信号通路、代谢过程、细胞及遗传信息功能,以及肿瘤、病毒性心肌炎、非酒精性脂肪肝、原发性免疫缺陷、类风湿关节炎、多种病毒原虫及细菌感染、阿尔茨海默病、亨廷顿病等多种疾病。其中,下调蛋白主要参与流感病毒等病毒和细菌感染、亨廷顿病等中枢神经系统疾病、NF-κB等信号通路、细胞因子介导信号通路等;上调蛋白主要参与类风湿关节炎等自身免疫病、膀胱癌等肿瘤、多种病毒原虫及细菌感染、NF-κB等信号通路、细胞因子介导信号通路等。COG注释分析显示,差异蛋白参与生理功能包括:能量产生与转换;细胞周期调控、分化、染色体分区;核苷酸转运和代谢;碳水化合物转运和代谢;酶分子转运和代谢;脂质转运和代谢;翻译、核糖体结构和生物合成;转录;复制、重组和修复;翻译后修饰、分子伴侣;无机离子转运和代谢;信号转导机制;细胞内运输、分泌、囊泡转运。其中,下调蛋白主要参与翻译后修饰、分子伴侣;细胞周期调控、分化、染色体分区;碳水化合物转运和代谢;翻译、核糖体结构和生物合成,等。而上调蛋白主要参与酶分子转运和代谢;脂质转运和代谢;转录;翻译后修饰、分子伴侣。

2.5hcmv-miR-US25-1-3p对靶蛋白表达调控验证 为验证蛋白组学结果,通过文献调研发现,TRAIL和RANTES蛋白在HCMV感染过程中发挥重要作用,据此被选定为验证靶蛋白。经RNAhybrid对hcmv-miR-US25-1-3p与TRAIL和RANTES的mRNA 3′-UTR预测,其结合自由能分别为-22.1 kcal/mol和-22.3 kcal/mol,见图3。进一步western blot结果显示,过表达hcmv-miR-US25-1-3p可显著抑制TRAIL和RANTES蛋白表达,见图4。

图3 hcmv-miR-US25-1-3p与候选靶基因的mRNA 3′-UTR预测

注:* ,P<0.05;** ,P<0.01。

3 讨论

病毒感染可引起宿主细胞蛋白质表达水平的变化,进而影响细胞正常生理功能,基于蛋白质组学技术研究病毒感染宿主细胞后差异蛋白表达谱有助于进一步揭示病毒与宿主细胞的相互作用及病毒的致病机制[10]。HCMV在人群中有极高的潜伏感染率,其在感染过程中通过编码多种miRNA作用于病毒或宿主细胞基因,发挥调节病毒和宿主细胞功能[11]。本课题组前期研究揭示HCMV激活感染患者外周血中hcmv-miR-US25-1-3p水平显著高表达[6],但对于其参与病毒感染及临床相关疾病的分子机制尚未见报道。因此,为探讨hcmv-miR-US25-1-3p作用靶基因及其参与病毒感染及宿主疾病发生发展的可能分子机制,本研究采用TMT联合LC-MS/MS蛋白组学技术[12-13]进行hcmv-miR-US25-1-3p过表达对THP-1细胞蛋白的影响及可能靶基因筛选、验证探讨,发现hcmv-miR-US25-1-3p可明显影响THP-1细胞蛋白表达,且差异表达蛋白参与病原体感染等病理过程,其中免疫相关TRAIL和RANTES蛋白经western blot验证,可明显受hcmv-miR-US25-1-5p调控,表明二者可能是HCMV感染及相关病理过程中发挥重要作用的靶基因。

RANTES为受激活调节正常T细胞表达和分泌因子,属于趋化因子CC家族(CCL5),其受体包括CC趋化因子受体(C-C motif chemokine receptor,CCR)1、3、4和5,其中CCR5亲和力最高。CCL5/CCR5轴下游通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶、NF-κB、低氧诱导因子、RAS-ERK-MEK、JAK-STAT、TGF-β-SMAD,涉及细胞增殖、血管再生、凋亡、侵袭、分化、转移和炎症反应[14-16]。研究发现,CCL5/CCR5参与类风湿关节炎、炎症性肠病等自身免疫病,在动脉粥样硬化、肝炎、肿瘤及各种病原体感染如新型冠状病毒肺炎(COVID-19)炎症反应中发挥促进疾病进程功能[15]。由此可见,CCL5/CCR5参与炎症、肿瘤、病毒感染和免疫反应。在HCMV感染过程中,病毒通过编码pUL21.5蛋白以高亲和力选择性结合RANTES,阻断RANTES与其细胞受体的结合,在宿主抗病毒感染过程中发挥免疫调节作用[17];既往研究显示,HCMV亦可通过编码hcmv-miR-UL148d靶向RANTES并降低RANTES表达而发挥免疫调节功能[18]。本研究发现hcmv-miR-US25-1-3p同样可靶向RANTES分子,提示其同样可抑制免疫细胞反应性,达到抑制宿主对病毒的杀伤,维持病毒潜伏状态。有研究显示,阻断CCL5/CCR5可能通过抑制炎性细胞因子来减轻由单纯疱疹病毒1型引起的异常性疼痛和痛觉过敏,并有望成为单纯疱疹病毒1型感染导致疱疹相关疼痛的治疗靶点[19]。而本研究结果则提示hcmv-miR-US25-1-3p通过作用RANTES并使其下调,进而促进病毒潜伏、免于宿主细胞杀伤。

TRAIL为Apo2配体/TNF相关凋亡诱导配体(Apo2 ligand/TNF related apoptosis-inducing ligand,Apo2L/TRAIL),又名TNFSF10,属TNF家族成员,多种免疫细胞包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和NK细胞在一定的刺激下可表达[20]。TRAIL作为免疫效应分子发挥免疫调节功能,参与感染过程、诱导细胞凋亡、自身免疫病等[21-23]。TRAIL在病毒感染发生过程中发挥抗病毒功能。HCMV通过编码hcmv-miR-US25-1-3p作用TRAIL分子并使其表达降低,使得宿主细胞杀伤病毒感染细胞能力降低,有利于病毒的免疫逃逸。

本研究基于蛋白质组学技术探讨hcmv-miR-US25-1-3p作用靶点及其参与疾病分子机制。通过GO、COG和KEGG注释及功能预测研究发现,差异表达蛋白主要参与感染相关炎症、抗病毒等。hcmv-miR-US25-1-3p可能通过作用TRAIL和RANTES并使其表达下调,进而促进病毒潜伏、免于宿主细胞杀伤。为进一步揭示HCMV miRNA在病毒感染过程中功能发挥提供一定依据,并为寻找抗病毒治疗靶点研究提供新的方向。本研究基于蛋白质组学,可直观展示miRNA作用基因的蛋白质水平。但是,病毒感染是一个复杂的过程。HCMV在潜伏向激活转变中存在很多miRNA的表达增加,而仅采取体外细胞转染方式给予其中一个miRNA仍存在片面性,miRNA与蛋白质间靶向关系的多样性仍有待后续深入评估。