基于SSR分子标记的多花水仙资源遗传多样性分析

田奇琳, 何炎森, 敬月美, 余惠文, 朱 旸, 陈郑镔, 陆銮眉

(1.闽南师范大学,闽台特色园林植物福建省高校重点实验室, 福建 漳州 363000;2.福建省农业科学院亚热带农业研究所, 福建 漳州 363005)

水仙(Narcissus)属于石蒜科水仙属多年生草本植物,主要分布于欧洲和地中海沿岸等地,其单株花量大,具有特殊香味,具有较高的观赏价值和药用价值[1-3]。英国皇家园艺学会将水仙分为1个植物学分类和12个园艺学分类:喇叭水仙、大杯水仙、小杯水仙、重瓣水仙、三蕊水仙、仙客来水仙、丁香水仙、多花水仙、红口水仙、围裙水仙、副冠开裂水仙和其他[4]。中国水仙(Narcissus.tazettavar.chinensis)属法国多花水仙中的变种,为中国著名的十大传统名花之一,主要分布在东南沿海一带,按地区划分有漳州水仙、崇明水仙、舟山水仙等,其中漳州水仙最具代表性[5-6]。尽管目前国内针对水仙属种质资源的资源分布、遗传多样性、引种试种等方面进行了大量研究,总体开发利用仍较为薄弱。福建农林大学园艺学院选育出3个多花水仙特色新品种“黄花2号”[7]、“云香”[8]和“金玉”[9];王金英[10]以引进的20个欧洲水仙品种为试验材料,调查欧洲水仙在福州地区的生长繁殖情况和环境适应性,进行了形态学、解剖学方面的研究,并将研究结果应用于水仙属植物的分类比较;何炎森等[11]对多个多花水仙品种进行露地栽培并比较其物候期和观赏性状。目前国内水仙品种极度匮乏,生产上栽培的中国水仙,主要为“金盏银台”和“玉玲珑”,品种多样性不足;长期的无性繁殖导致水仙存在着病毒侵染、品质退化等问题[12]。此外,培育水仙新品种较为困难,中国水仙栽培品种为三倍体,利用传统的杂交育种等方法难以获得新品种[13];水仙缺乏全基因组数据,且组织培养植株再生率普遍较低,遗传转化率低,性状改良瓶颈凸显[14-15]。引进适合国内气候下栽培的水仙资源以丰富国内水仙类型和优良育种亲本资源是水仙种质资源创新的首要任务。因此,开展国内外水仙种质资源遗传多样性研究十分必要。

DNA分子标记技术是植物遗传多样性研究和资源亲缘关系鉴定的重要手段之一。目前,RAPD标记[16-18]、ISSR[19-20]、AFLP[21-22]分子标记技术在水仙属植物遗传多样性研究方面均有应用。简单序列重复(Simple Sequence Repeats, SSR),又称微卫星DNA(Microsatellite DNA),是一段由几个核苷酸为单位的重复DNA序列,广泛分布于生物基因组中;SSR标记遵循孟德尔共显性遗传模式,具有多态性较高、重复性高等许多优点,是遗传多样性分析中常用的分子标记技术之一[23-24]。随着高通量测序技术的快速发展,SSR标记的开发与应用将极大推进植物分子育种研究。SSR分子标记作为水仙属植物遗传多样性和种质资源鉴定的重要分子标记,目前在水仙属植物遗传多样性研究方面已有少数应用。祁世明等[24-25]建立并优化了水仙的SSR-PCR反应体系,从开发的引物中筛选SSR标记引物,对引物的多态性、重复性等进行了验证,并对部分水仙资源进行了遗传多样性研究。刘洋[26]利用“云香”水仙不同花期转录组数据设计了SSR标记引物,并进行可靠性检测。目前真正得到推广利用的水仙资源仍极少。鉴于此,本研究基于前期收集、保存和引进栽培的多花水仙种质资源,应用SSR分子标记技术开展国内外多花水仙种质资源遗传多样性研究,旨在为水仙传统育种结合生物技术育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验材料多花水仙资源采自福建省农业科学院亚热带农业研究所的水仙花资源圃,具体信息见表1。

表1 多花水仙资源Table 1 Narcissus tazetta resources

试剂:丙烯酰胺,脲,Tris-base,N,N-甲叉双丙烯酰胺,硼酸,EDTA(乙二胺四乙酸二钠),TEMED(四甲基乙二胺),冰醋酸,95%乙醇,过硫酸铵(APS),反硅化剂,硅化剂,无水碳酸钠,硝酸银,氢氧化钠,甲醛溶液,二甲苯青,甲酰胺,溴酚蓝等。

1.2 仪器设备

高速离心机,水浴锅,通风橱,微波炉,超微量紫外分光光度计,电泳仪、PCR扩增仪等。

1.3 实验方法

1.3.1DNA提取

采用上海惠凌生物科技有限公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取,操作参照说明书。提取21个多花水仙资源的DNA,通过超微量分光光度计的测定,将A260/A280值在1.8～2.0的DNA样品,用琼脂糖电泳再检测DNA完整性。最后将合格的DNA样品稀释终浓度至100 ng/μL,保存备用。

1.3.2SSR-PCR 扩增

将提取的多花水仙资源DNA作为模板,进行SSR-PCR 扩增,对SSR引物进行筛选。本研究中,引物CATACA 5、TA 34、TCA 9、AT 15选自祁世明等[25]的研究,引物NtSSR 2、NtSSR 4、NtSSR 12、NtSSR 13、NtSSR 18、NtSSR 19选自刘洋[26]的研究,引物Xgwm 469选自袁菊红[27]的研究(表2);另外,基于中国水仙“玉玲珑”转录组数据,进一步开发新的SSR标记引物,引物委托厦门擎科生物技术有限公司合成。PCR扩增程序为:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性30 s,49～56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s进行35个循环,72 ℃延伸5 min。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3.3聚丙烯凝胶电泳

聚丙烯凝胶电泳参照余惠文等[28]的方法进行。将水仙DNA的PCR扩增产物变性后加入预电泳好的胶孔中,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结果拍照保存,读取条带用于后续相关分析。

1.3.4数据统计与分析

将聚丙烯酰胺凝胶电泳数据录入NTsys-pc 2.10 e软件,对21份多花水仙资源进行主成分分析和非加权算术平均聚类(UPGMA)分析。使用Popgen 32软件计算引物多态性百分率、观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s遗传多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)。

2 结果与分析

2.1 引物多态性分析

基于“玉玲珑”水仙转录组数据,从新设计的32对引物中通过SSR-PCR筛选得到6对SSR标记引物用于本研究,分别为N 10、N 16、N 21、N 22、N 24、N 32(表3)。结合前人研究,最终从76对引物中筛选出17对扩增的条带清晰且有多态性的引物(表2和表3)。利用POPGEN 32软件进行各项遗传参数分析,17对SSR引物在21份水仙资源中共扩增出106个位点,其中有99个多态性位点,多态性位点比例为93.40%,表现为较高的多态性水平。每对引物产生的位点数在2～12之间,平均每对引物扩增出6.2个位点和5.8个多态性位点。17对引物的Nei’s遗传多样性指数为0.266 7,Shannon信息指数为0.411 7(表4),这17对引物中有3个引物的观测等位基因数在1～2之间,其余14个的观测等位基因数均是2。新开发的6对SSR标记引物中,N 10、N 21、N 24和N 32多态性百分率在90%以上,N 16和N 22多态性百分率为80%～90%。在本研究所的17对引物中,有效等位基因数、Nei’s遗传多样性指数和Shannon信息指数最高的引物N 32,最低的是引物NtSSR 2。

表3 SSR-PCR筛选获得的引物序列Table 3 Primer sequences obtained by SSR-PCR screening

表4 17对引物扩增结果Table 4 Amplification results of 17 pairs of primers

2.2 多花水仙资源主成分分析与亲缘关系分析

2.2.1多花水仙资源主成分分析

用NTsys-pc 2.10e软件对21份多花水仙资源进行遗传多样性矩阵的主成分分析。由图1可看出,供试多花水仙种质资源可被分为四类,第Ⅰ类主要是来自漳州、平潭、南日岛、崇明和普陀的中国水仙;第Ⅱ类为“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”;第Ⅲ类为“白花1号”“白花2号”“崇明白”和“Ziva”水仙;第Ⅳ类为“云香”“六横白”“Pearl”。

图1 21份多花水仙主成分分析Fig.1 Principal component analysis of 21 resources of N. tazetta

图2 21份多花水仙资源的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 21 resources of N. tazetta

2.2.2多花水仙资源亲缘关系分析

21份水仙种质资源的遗传相似系数在0.443 4～1.000 0之间。在遗传相似系数为0.74处,可将多花水仙资源分为四类,第Ⅰ类有12个多花水仙资源,含“金三角”“平潭单瓣”“漳州单瓣”“南日岛野生”“Chinese Sacred Lily”“崇明复瓣”“漳州单瓣”“平潭野生”“崇明单瓣”“普陀复瓣”“绿状元”“普陀单瓣”,其中除“绿状元”(花被绿色)外,均为黄白双色花。第Ⅱ类有2个多花水仙资源,为“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”,均为黄色花。第Ⅲ类有4个多花水仙资源,分别为“白花1号”“白花2号”“崇明白”“Ziva”,均为白色花。第Ⅳ类有3个多花水仙资源,分别为“云香”“六横白”和“Pearl”,均为白色花被,浅黄色副冠,UPGMA聚类结果和主成分分析结果一致。

本研究表明,亲缘关系最近的是“平潭单瓣”“漳州单瓣”“南日岛野生”“Chinese Sacred Lily”“崇明复瓣”“漳州单瓣”“平潭野生”“崇明单瓣”“普陀复瓣”“绿状元”和“普陀单瓣”。“Grand Soleil d′Or”“Ziva”和“Pearl”为洋水仙,其中“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”亲缘关系较近,“Ziva”和“崇明白”亲缘关系较近,“Pearl”和“云香”“六横白”有较近的亲缘关系。

对21份多花水仙聚类的4个类群用POPGEN 32软件进行各项遗传参数分析,结果(表5)表明,第Ⅲ类群的多态性百分率(33.02%)、观测等位基因数(1.330 2)、有效等位基因数(1.226 1)、Nei’s遗传多样性指数(0.130 4)和Shannon信息指数(0.191 6)均最高,第Ⅳ类群最低。说明第Ⅲ类群的遗传多样性是4个类群中最高的, 第Ⅳ类群的遗传多样性最低。

表5 4个多花水仙类群的遗传多样性Table 5 Genetic diversity of four N. tazetta groups

3 讨 论

本研究筛选得到的17对SSR标记引物可以较好地将供试水仙资源从DNA水平上区分开来,21份多花水仙种质资源的遗传相似系数在0.443 4～1.000 0之间。中国水仙与其他多花水仙类群间的遗传相似系数较低,遗传多样性较高,亲缘关系较远。通过UPGMA聚类分析可知,国内漳州、崇明、舟山、平潭等地的中国水仙单复瓣种质都聚在Ⅰ类群,表现其亲缘关系较近。中国水仙表型特征相似,其中, “金三角”与“漳州单瓣”主要差异是副冠三裂,“绿状元”与“漳州复瓣”主要差异是颜色为绿色[29-30]。 可见,“金三角”和“绿状元”虽与其他中国水仙资源表型存在差异,但与中国水仙主栽品种均表现出很高的遗传相似性。中国水仙所属的Ⅰ类群与洋水仙(“Grand Soleil d′Or”“Ziva”和“Pearl”)所在的类群(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)遗传相似系数在0.4～0.8之间,表现出较远的亲缘关系,与Liu等[31]的研究结果类似。另外在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ类群中,“Grand Soleil d′Or”与“彩色水仙”亲缘关系较近;“Ziva”与“崇明白”亲缘关系较近;“Pearl”与 “云香”和“六横白”表现出较近的亲缘关系。不同种质水仙间亲缘关系的区分和种质认证有利于优良水仙亲本资源的保存和水仙种质创新利用。

袁菊红[27]利用18对SSR引物对石蒜属15个种和外类群中国水仙进行了SSR-PCR扩增,分析石蒜属植物的遗传多样性和种间亲缘关系。祁世明等[24-25]开发了29对水仙BES-SSR标记引物,并通过对SSR-PCR扩增反应体系中的相关因素进行优化,建立了适合水仙SSR标记分析的标准化体系。在前人研究基础上,本研究以21份多花水仙为材料,基于中国水仙“玉玲珑”转录组数据进一步开发的6对SSR标记引物,其条带较清晰,非特异性条带较少,多态性较高,通用性好。本研究新开发的引物可丰富水仙SSR标记引物数量,为水仙属遗传多样性研究和种质资源鉴定方面奠定基础。另外,本研究选用的17对引物并不能很好区分漳州、崇明、舟山、平潭等地的中国水仙单复瓣种质,仍需进一步开发特异性分子标记及其引物,有助于有效揭示中国水仙不同群体间的遗传变异。本研究中,不同地区的中国水仙群体间遗传多样性水平低,结果与Lin等[31]、朱弘等[32]研究结论相似。探讨国内外多花水仙的遗传多样性和亲缘关系,可以为水仙育种和种质认证研究提供科学依据,进一步丰富、开发和利用国内外水仙种质资源,推进水仙市场的发展。