热应激影响奶牛胚胎发育作用机制的研究进展

张 航,杨柏高,徐 茜,冯肖艺,杜卫华,郝海生,朱化彬,张培培,赵学明

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193)

奶业是关系国计民生的重要基础性产业。近年来,随着经济的不断发展,我国牛奶产量及城乡居民奶类消费逐年提升[1]。据统计,2021年我国牛奶产量达3 683万吨,比上年增长7.1%[2],与此同时,2021年我国人均奶类消费达42.3 kg,较上年增长10.2%[2],由此可见,牛奶已逐渐成为国民生活中不可替代的食品之一。2018年,国务院办公厅发布《关于推进奶业振兴保障乳制品质量安全的意见》,并在文件中明确指出“奶业是健康中国、强壮民族不可或缺的产业”。2022年,为进一步提升我国奶业竞争力,保障奶类供给安全,农业农村部发布《“十四五”奶业竞争力提升行动方案》,再次表明了奶业振兴意义之重大。

然而,夏季高温高湿环境极易诱发奶牛热应激,进而对奶业发展造成严重威胁。研究表明,当温度湿度指数(temperature-humidity index,THI)≥72时,奶牛自身无法实现充分散热,便会出现热应激,奶牛的生产及繁殖性能随之受到严重影响[3]。Thornton等[4]的研究指出,如果世界一直处于高碳排放发展模式(SSP5-8.5),全球变暖将进一步加剧奶牛热应激风险,到21世纪末期(2085年),由产奶量减少带来的经济损失将高达91.4亿美元,占2005年全球牛奶生产价值的4.7%。2080年,仅美国奶业的损失便将高达22亿美元[5]。若以热带牲畜单位(tropical livestock units,TLU)计算,本世纪末期中国每TLU产奶量相较2005年将减少5.4%,而巴西将减少13.1%[4]。此外,热应激还导致奶牛繁殖力大幅下降。与冬季相比,奶牛在夏季的受孕率要低20%～30%[6]。统计资料显示,2000—2017年连续18年,以色列夏季奶牛受孕率约为27.7%,显著低于冬季的42.6%[7]。Gernand等[8]的研究还指出,当THI=80时,奶牛受孕率由约35%(THI<65)显著降低至约16%。不仅如此,随着气候变暖问题不断恶化,热应激对奶牛的危害还将进一步增加[9]。据推测,到2050年及2070年,我国THI指数还将出现大幅上涨[10],由此可见,热应激对我国奶业发展的威胁不容小觑。

本文主要就热应激对奶牛内分泌、卵母细胞和胚胎发育的作用机制以及通过物理降温、激素调节内分泌、优化卵母细胞培养体系、基因编辑等缓解奶牛热应激影响的解决措施进行阐述,以期为缓解奶牛热应激导致繁殖性能下降的产业问题提供思考。

1 热应激影响奶牛胚胎发育的机制

1.1 热应激对内分泌的影响

热应激能够直接对奶牛的内分泌系统造成影响,进而干扰奶牛排卵及妊娠等正常繁殖行为,影响奶牛繁殖性能。

当发生急性热应激时,奶牛体内应激激素(如皮质醇)水平升高,从而对下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO轴)造成影响,使促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)和促性腺激素(gonadotropins,Gn)分泌减少并抑制卵巢活动,如:促黄体生成素(luteotropic hormone,LH)的分泌受热应激影响而被抑制[11]。排卵前LH分泌出现延迟,增加了排卵失败和卵巢囊肿的风险。低水平的LH还可能影响黄体的形成,这被认为是降低胚胎存活率的重要原因之一[11]。

当发生慢性热应激时,奶牛孕酮(progesterone,P4)水平出现大幅下降,严重影响奶牛繁殖机能。慢性热应激会导致奶牛卵泡发育异常,阻碍黄体形成并引起黄体功能受损,进而影响P4分泌[12]。P4由卵巢黄体分泌,主要影响胚胎的发育生长及干扰素Tau的生成,进而影响胚胎着床[13]。Nanas等[14]认为,高水平的P4是保障早期胚胎正常发育的最关键因素之一,P4水平下降将导致胚胎死亡率大大增加。此外,慢性热应激还会引起奶牛分泌皮质醇浓度减少,血液中葡萄糖水平降低,进而使机体抵御热应激的能力减弱,导致妊娠率降低[15]。

1.2 热应激对卵母细胞的影响

热应激对卵母细胞的影响主要体现在奶牛排卵以及卵母细胞的发育、成熟过程中,进而损害卵母细胞发育成胚胎的能力。Stamperna等[16]的研究表明,热应激导致荷斯坦奶牛卵母细胞发育成囊胚的比例由30.3%降低至21.5%,利木赞牛由25.8%降低至14.2%。

奶牛的正常排卵依赖于精密的激素调节系统,而热应激会导致奶牛体内激素水平改变,进而损害奶牛正常排卵。由于热应激引起奶牛内分泌紊乱,引发奶牛卵泡发育异常,优势卵泡的大小及优势度降低,甚至生长出额外的大卵泡,导致热应激奶牛产下双胞胎的可能性升高,卵母细胞的发育质量也会受到卵泡异常的影响而出现下降[17]。即便到了温度相对较低的夏季末、秋季甚至初冬季节,奶牛卵泡液中雌二醇含量依旧维持在较低水平,这将导致LH分泌受到抑制,奶牛发情及排卵异常,进而引起持续性卵泡及囊肿形成,而这也表明热应激对奶牛卵巢卵泡的影响存在长时间的负面作用[11]。

当卵母细胞发育过程中遭受热应激时,卵母细胞染色质凝聚出现异常,早期胚胎染色质重塑同样受到严重影响。研究表明,夏季奶牛卵母细胞染色质致密程度大大降低,其发育至胚胎的能力随之减弱。与此同时,牛卵丘细胞中DNA碎片化程度增加,凋亡比例大幅提高,进而影响卵母细胞胞质成熟,并进一步损害卵母细胞染色质凝聚[18]。Camargo等[19]指出,当卵母细胞体外成熟过程中遭受热应激时,四细胞期胚胎中H3K9me3和HP1出现异常积聚,进而影响胚胎染色质重塑,并导致胚胎基因组激活及基因表达异常,胚胎发育严重受损。

热应激还会增加卵母细胞遭受氧化应激损伤的风险。谷胱甘肽是一种高效的抗氧化剂,能有效清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)保护细胞免受氧化损伤,而热应激引起卵母细胞内谷胱甘肽水平降低,导致卵母细胞更易遭受氧化应激影响[20]。牛卵母细胞膜脂肪酸含量丰富,膜脂肪酸的含量及组成成分对牛卵母细胞后期发育至关重要。而在夏季高温条件下,牛卵母细胞和颗粒细胞中饱和脂肪酸的比例升高,且高于单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸,这主要是由于温度升高引起牛卵母细胞ROS水平增加,加剧卵母细胞遭受氧化应激损伤[21]。

此外,热应激引起牛卵母细胞微管蛋白和微丝受损。微管蛋白和微丝作为细胞骨架参与细胞核和细胞器的运输,而细胞骨架改变将引起卵母细胞成熟异常,卵母细胞的成熟时间或将因此提前,进而增加受精失败及胚胎发育异常的风险[22]。同时,线粒体的运输也要依赖细胞骨架,夏季奶牛卵母细胞细胞骨架损伤导致线粒体分布异常概率增加,这也被认为是影响卵母细胞发育的重要原因[22]。

1.3 热应激对胚胎的影响

热应激能引起母体体内温度升高并导致母体生理状态改变,进而影响奶牛胚胎发育,导致奶牛受孕率降低。Cordeiro等[23]的研究指出,当THI由73.1升高至75.7时,胚胎移植奶牛受孕率由56.3%降低至33.3%。Abdel等[24]指出,当THI≥73时,性控胚胎移植奶牛受孕率由52.50%降低至35.71%。

早期胚胎对高温十分敏感。在受精当天至胚胎发育到2细胞期之间,若奶牛处于热应激环境中,则随后胚胎囊胚率便会出现明显下降[22]。Stamperna等[25]的研究表明,热应激会导致牛早期胚胎基因表达紊乱。他们的研究指出,GSTP1、BAX1、PTGS2、DNMT3、TLR4、PLAC8、AKR1B1、HSF1和HSPA1A的表达存在协同性,对胚胎的正常发育至关重要,而热应激导致这些基因表达的协调性丧失。与此同时,热应激还导致胚胎中氧化应激相关基因(如:COX1、AKR7A2、CBR1、GGH、GSTA4等)表达增加,胚胎发育质量相关基因(如:AQP3、ATP1A1等)表达减少,进一步反映热应激对胚胎发育造成损伤[26]。

胚胎发育至4细胞期时便开始获得热耐受能力,一直到囊胚阶段,胚胎的耐热能力会不断增强,此时热应激对胚胎发育的影响相对有限[21]。研究表明,当胚胎分裂至8～16细胞期时,胚胎基因组激活,转录活性增加,此时热应激相关蛋白及内源性抗氧化酶基因转录激活,胚胎耐热性大幅增加[25]。在此阶段,胚胎即便遭遇热应激,依旧具有继续发育的能力。不过,热应激一定程度上还是会对该阶段胚胎造成损伤,但在胚胎体外培养过程中使用抗氧化剂处理可以有效缓解这一情况[14]。

除了温度升高直接影响胚胎发育外,热应激还会改变奶牛体内激素浓度,引起输卵管及子宫环境变化,进而影响胚胎发育[27]。妊娠后期时,热应激能引起奶牛母体体温升高,进而诱发胎儿宫内生长迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR),导致胎儿早产或胎儿过小[28]。此外,由于热应激引起奶牛采食量减少,奶牛营养不足,供给胚胎的营养也会减少。奶牛机体散热增加导致流经子宫血液减少,进而引起胚胎发育所需的养分、氧气及水分相对不足,胚胎发育受阻。热应激引起的奶牛内分泌紊乱也增加了胎儿流产的可能[29]。

2 改善热应激奶牛胚胎发育的措施

2.1 改进奶牛饲养管理

2.1.1 物理降温 物理降温是缓解奶牛热应激的主要策略。传统降温方式包括直接法和间接法。其中,直接法通过强制蒸发动物体表水分以达到降温目的,而间接法则通过遮荫、洒水等方式降低环境温度,从而间接帮助奶牛散热[30]。以色列夏季温度高、湿度达50%～90%,因此当地奶牛养殖常采用直接法帮助奶牛降温,即:用水喷洒奶牛30秒,通风4.5 min,每次循环进行30～45 min,每日5～7次,用此方法,奶牛体温降至39 ℃以下,受孕率从17%显著提高至57%,热应激现象得到有效缓解[31]。此外,添加遮荫设备,减少阳光直射,也是帮助奶牛降温的有效手段。有研究指出,太阳能电池板既能提供遮荫,还能生产电能,其遮荫效果也大大优于传统遮阳布,在缓解奶牛热应激的同时提高了农民收入,促进了畜牧业的可持续发展[32]。研究表明,奶牛在太阳能电池板遮荫条件下,体表温度降低6 ℃[33],而为每头奶牛提供3 m2的遮荫便能有效阻隔光照[32]。随着太阳能电池板价格的不断降低,这种新型的遮阳方式或将具有广阔的前景[32]。

2.1.2 激素缓解内分泌紊乱 激素治疗是调节奶牛内分泌的重要途径,能有效缓解热应激引起的奶牛内分泌紊乱。热应激通过破坏奶牛激素水平,引发卵泡发育异常并损害卵母细胞及胚胎的发育,造成奶牛繁殖力大幅下降[30]。通过反复注射GnRH和前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)能够诱导卵泡生成,去除受损卵泡,进而减少热应激对卵泡功能的负面影响[34]。此外,高温会抑制黄体功能,导致P4分泌减少,进而影响胚胎着床甚至造成胚胎死亡[35],而补充P4则被认为是有效的应对策略[30]。研究表明,联用GnRH-PGF2α和P4能进一步提高热应激奶牛的繁殖力[34]。

然而,无论是物理降温还是激素治疗,都只能有限地挽救热应激奶牛的繁殖力[34]。因此,开发更多抗热应激方式与这两种方法联合使用,或将进一步促进热应激条件下奶牛胚胎发育。

2.2 添加IGF1改进体外胚胎生产体系

胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factors 1,IGF1)具有促进细胞增殖[36-37]、抗凋亡等作用[38],能有效保护细胞免受各类应激伤害。研究表明,添加IGF1可以促进体外胚胎发育并提高胚胎在发育过程中对热应激的抵抗力[39],是改善体外生产胚胎耐热性的有效手段。

2.2.1 IGF1提高卵母细胞抗热应激能力 IGF1能从多方面缓解热应激对繁殖带来的负面影响,包括促进热应激条件下卵母细胞成熟、胚胎发育及提高热应激胚胎移植后的妊娠率等。Ascari等[40]的研究显示,添加IGF1能够提高热应激卵母细胞线粒体膜电位,减少囊胚内细胞团的细胞凋亡。他们指出,高温等应激条件会刺激卵母细胞线粒体膜通透性转换孔开放,引起线粒体膜电位及线粒体活性降低,进而导致囊胚质量下降,而IGF1有效改善了这一情况。Rodrigues等[41]认为,热应激会导致卵母细胞线粒体异常,引起线粒体途径的细胞凋亡,而IGF1能通过PI3K/Akt途径改善线粒体功能,提高线粒体膜电位,进而提高热应激条件下牛卵母细胞存活率。

此外,Rodrigues等[41]的研究还表明热应激主要损伤卵母细胞细胞质,引起细胞骨架损伤,干扰细胞发育。当卵母细胞处于热应激条件下时,胞内钙离子浓度升高,促进凝溶胶蛋白活化。该蛋白活化后能结合G-肌动蛋白单体及微丝,引起微丝断裂或解体,纺锤体形态异常,进而干扰卵母细胞减数分裂。他们认为,添加IGF1能激活p70S6激酶,从而增加微丝稳定性,减小热应激对细胞骨架造成的损伤。

Lima等[42]还指出,IGF1对热应激卵母细胞发育能力的改善效果很大程度上依赖于IGF1的浓度。当IGF1添加浓度过高时,反而会抑制IGF1R蛋白的表达,对卵母细胞及胚胎的发育造成负面影响。而添加生理浓度的IGF1(12.5 ng·mL-1)能更有效地抵御热应激带来的负面影响。

2.2.2 IGF1提高胚胎抗热应激能力 添加IGF1能有效改善热应激状态下奶牛胚胎的发育情况,显著提高夏季奶牛妊娠率及产仔率[43]。Jousan和Hansen[39]的研究发现,添加IGF1能有效减少热应激胚胎凋亡并促进热应激胚胎发育至囊胚阶段。添加IGF1还会减少胚胎中HSp70 mRNA。细胞在遭受应激条件刺激时会促进HSp70表达升高以阻止细胞凋亡,而HSp70 mRNA的减少证明IGF1能有效减少细胞应激带来的负面影响[44]。

IGF1能通过调控基因表达进而提高胚胎的热应激耐受力。Bonilla等[45]指出,添加IGF1会引起胚胎中涉及凋亡、抗氧化等功能的基因出现差异表达,其中包括IL6ST在内的5个抗凋亡基因上调,DPYSL4等5个促凋亡基因下调,GSTM2等两个抗氧化基因上调,而IGF1提高胚胎的抗热应激能力或许和这些基因的差异表达有关。

IGF1还通过PI3K/Akt信号通路及MAPK信号通路提高胚胎对热应激的抵抗力。Jousan等[46]的研究指出,当胚胎发生热应激时,IGF1激活PI3K/Akt信号通路发挥抗凋亡作用。Akt能够抑制Bad、caspase-9等促凋亡蛋白的表达,同时促进Bcl-2、Bcl-x等抗凋亡蛋白水平升高,进而提高热应激条件下胚胎的存活率。此外,IGF1通过激活MAPK信号通路促进胚胎细胞增殖,进而促进热应激条件下胚胎的发育。

2.2.3 IGF1联用其他药物 IGF1与其他药物联用或许能发挥更强大的抗热应激效果。热应激会从多方面损伤卵母细胞及胚胎的发育能力,包括诱导凋亡、损伤线粒体功能、促进氧化应激等[47]。而IGF1提高胚胎抗热应激能力主要依赖于PI3K/Akt和MAPK信号通路对胚胎凋亡的抑制作用及对胚胎发育的促进作用[46]。因此,在体外胚胎生产过程中,选择高效的线粒体保护药物或抗氧化剂与IGF1联用,或能进一步促进IGF1对胚胎抗热应激能力的提升效果。

辅酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)是线粒体呼吸链上的关键成分,具有增强线粒体功能、抗氧化等效果。Gendelman和Roth[48]的研究表明,添加CoQ10能显著提高秋季牛卵母细胞发育到囊胚的能力,并改善卵母细胞线粒体分布。CoQ10通过提高线粒体质量、抑制氧化应激进而促进卵母细胞发育的能力已在牛[49]、猪[50]、小鼠[51-52]等多个物种上得到证明。

褪黑素(melatonin,MT)是一种高效的抗氧化剂,能有效减少热应激期间ROS对卵母细胞发育造成的氧化损伤。研究表明,添加褪黑素有效减少了热应激条件下卵母细胞ROS的产生[53],促进线粒体功能相关基因转录[54],并提高热应激条件下卵母细胞发育成囊胚的能力[55]。还有研究指出,褪黑素能调节卵母细胞及胚胎发育过程中表观遗传修饰[56],并促进卵母细胞发育相关基因(GDF9、MARF1和DNMT1a等)[57]、胚胎抗凋亡基因(BCL2L1等)表达,抑制促凋亡基因(p53、Bax等)表达[58],进而提高卵母细胞及胚胎的发育能力。

因此,在奶牛体外胚胎生产过程中,添加IGF1的同时联用CoQ10、褪黑素等药物,或许能更加有效的提高胚胎对热应激的抵抗能力。

2.3 基因编辑

2.3.1HSPA1L基因HSPA1L是热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的编码基因之一。研究表明,当HSPA1L启动子区发生胞嘧啶缺失突变时,细胞内HSPA1A/L 转录产物及HSP70表达量升高,进而增强细胞对热应激的耐受力。因此,利用基因编辑技术对牛胚胎HSPA1L基因进行修饰或是高效解决奶牛热应激问题的有力手段。

HSP70是大多生物细胞中含量最高的一类热休克蛋白,易受高热、高氧等多种应激条件诱导表达[59],能有效提高细胞对各类应激的耐受能力[60]。HSP70的作用包括:作为分子伴侣正确折叠、组装蛋白质,促进变性蛋白降解,抑制细胞凋亡等[60],能有效帮助细胞缓解热应激造成的损伤。Stamperna等[61]的研究表明,在牛卵母细胞体外成熟过程中添加HSP70能够促进胚胎发育过程中信号转导,增强胚胎抗氧化能力,抑制胚胎凋亡发生,进而增强胚胎在发育过程中对热应激的耐受力。他们随后的研究还指出,在牛早期胚胎体外发育过程中添加HSP70能够有效缓解高温对胚胎发育的负面影响,显著提高热应激条件下的囊胚产量(15.9%→21.4%)[25]。

奶牛中HSPA1L和HSPA1A均为HSP70的编码基因,二者编码序列几乎完全相同,常规检测方法无法区分二者的转录产物[62]。研究表明,当HSPA1L启动子区第895位碱基处出现胞嘧啶缺失时,荷斯坦奶牛淋巴细胞对热应激的耐受力增加,HSPA1A/L 转录表达显著升高,HSP70蛋白表达水平升高[63]。Ortega等[64]指出,HSPA1L缺失突变能提高奶牛早期胚胎发育过程中对热应激的耐受力。胚胎发育早期对高温敏感,二细胞期胚胎受到热应激刺激时便通过转录HSPA1A/L抵抗热应激,而HSPA1L缺失突变能使该转录水平进一步提高[64],HSP70蛋白表达增加[63],进而帮助胚胎有效应对热应激造成的负面影响。他们的研究结果表明,在应激条件下(高氧、高温)培养牛胚胎,存活囊胚中HSPA1L缺失突变的频率更高,这意味着HSPA1L缺失突变能够增强奶牛胚胎对热应激的抵抗力,进而提高热应激条件下胚胎的存活率[64]。

2.3.2PRLR基因 奶牛毛发长度影响奶牛抗热应激的能力。在炎热环境中,被毛较短的牛能更加地高效散热,因此这类牛对热的耐受性更强[65]。研究表明,当催乳素受体基因(PRLR)上出现SLICK突变时,奶牛表现出短被毛的光滑表型,抗热应激的能力大大提高[62]。

催乳素(prolactin,PRL)具有抑制毛发生长[66]及毛囊发育[67]的功能。当PRLR上出现SLICK突变时,PRL对毛发的抑制作用被放大,进而导致牛呈现短毛、光滑表型[68]。哺乳动物PRLR主要包括长型(long form)和短型(short form)[69],而SLICK突变的PRLR长度介于长型PRLR和短型PRLR之间[62]。目前已知,PRLR上的SLICK突变有3种,包括SLICK1、SLICK2和SLICK3。其中,SLICK1突变发现于Senepol牛上,SLICK2突变发现于Carora和Criollo Limonero牛,而SLICK3突变在Criollo Limonero牛中被发现[62]。这3类突变均属于移码突变,能使PRLR的转录提前终止,形成“截短型受体”[62]。有研究指出,SLICK突变导致催乳素信号传导过程中参与JAK2/STAT5激活的蛋白质的C末端区域被截断[70],其中7个酪氨酸残基中有2个发生丢失[68],这或许会影响STAT5的激活[70]。不过,依赖PI3K/MAPK等途径进行信号传递的短型PRLR则不会受到影响[68]。在此基础上,牛表现出短毛性状,体温调节能力也随之增强[68]。

此外,SLICK1突变在提高牛抗热应激能力的同时未发现对牛存在负面影响。Carmickle等[71]的研究表明,携带SLICK1等位基因的荷斯坦奶牛犊牛的出生重、平均日增重及断奶重与野生型荷斯坦奶牛相似。Sosa等[68]指出,SLICK1等位基因杂合的荷斯坦奶牛直肠及瘤胃温度低于野生型。SLICK1突变还提高了荷斯坦奶牛体温调节的能力[72],并且不会对奶牛的胚胎发育造成负面影响[70]。不仅如此,由于短被毛的奶牛散热能力更强,对高温的耐受性也更高,因此短被毛奶牛在炎热环境中产奶量也高于野生型奶牛。而在寒冷季节,短被毛奶牛的产奶量则与野生型奶牛相似[73]。由此可见,短被毛性状或许能有效帮助奶牛应对高温环境,并提高奶牛产奶量[74]。

3 结 语

环境温度过高是引发奶牛热应激的直接原因。而热应激通过影响奶牛激素水平及干扰奶牛卵母细胞、胚胎的正常发育,进而破坏奶牛繁殖性能,造成巨大经济损失。因此,在奶牛养殖业发展中,急需寻找到高效、经济的应对热应激的方法。如:通过物理降温及激素治疗等手段,调节奶牛体温及内分泌水平;在体外胚胎生产过程中添加IGF1等药物,缓解胚胎发育过程中热应激造成的损伤;利用基因编辑技术修饰奶牛胚胎HSPA1L、PRLR等基因,改善胚胎及奶牛耐热性。联合使用多种抗热应激手段,或将从根本上有效提高热应激条件下胚胎的发育能力,具有广阔的发展前景。