不同物料堆肥过程中溶解性有机质和腐殖酸的物质结构演化时序差异分析

赵芹，程东会，王燕，赵昕宇，党秋玲*

1.长安大学水利与环境学院

2.中国环境科学研究院

溶解性有机质（DOM）是自然界中最复杂的混合物之一，由腐殖质和其他有机化合物组成，如氨基酸、碳水化合物、芳香族和脂肪族等[6]。在堆肥有机质中，DOM 占比仅有5%[7]，但却是堆肥有机质中活性最强的组成部分，具有生物化学活性强、迁移转化快、流动性好等特点，同时也是微生物生长的基质，与重金属相互作用，介导微生物与受体之间的电子转移，在全球碳氮循环、养分输出和生物地球化学行为中发挥着重要作用[8-10]。腐殖酸（HA）是一类以芳香核为主体、不溶于水且含有多种官能团结构的高度异质性的混合物质，在自然界中广泛存在。其化学结构比较复杂，存在带有不稳定质子的官能团，如羧酸、酚和胺，这些官能团能够结合质子和金属离子[11-12]，进而影响堆肥有机质的结构特性。HA 在操作上可进一步提取富里酸（黄腐酸）和胡敏酸（黑腐酸）。而HA 的特殊结构性质导致HA 在堆肥过程中的结构组成及其形成机制不同于DOM，尽管之前的研究已经为了解DOM 和HA 在堆肥过程中的形成过程提供了理论基础[13-14]，但目前在物料堆肥过程中提取的DOM和HA 的物质结构及其演化差异的研究甚少。充分了解不同堆肥过程中DOM 和HA 结构特性的差异，是正确认识DOM 和HA 的真实特征及其在堆肥环境中的化学行为的前提。

目前，国内外学者对DOM 和HA 结构组成提出了多种表征技术，如质谱、色谱、光谱等技术[8,15]，根据对有机质结构组成的跟踪需要，荧光光谱技术显示出了很大的应用前景[16]。笔者采用三维荧光光谱技术（3D-EEM）结合平行因子分析（EEM-PARAFAC）对比了鸡粪未添加菌剂堆肥（CM）、鸡粪添加菌剂堆肥（CMB）和餐厨垃圾堆肥（FW）分别提取的DOM与HA 的物质组成及其演化特征的差异，以期为后续定向调控堆肥过程中有机质物质结构转化，生成优质堆肥产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 堆肥样品

试验所用的餐厨垃圾和鸡粪堆肥原料由河北省石家庄市某餐厨场和某养殖场提供，稻壳取自石家庄市某粮食加工厂，试验所用芽孢杆菌取自山东省某微生物技术自主研发中心，有效活菌数（cfu）≥20 亿个/mL，添加比例为2‰（质量比）。试验于2021年5 月20 日—7 月20 日在石家庄市某堆肥厂进行。

1.2 试验设计

试验共设置3 种堆肥处理：CM、CMB 和FW 堆肥，每种处理均设3 次重复。将稻壳粉碎成粒径为0.5～1.0 cm，便于混合使用。将鸡粪、餐厨垃圾堆肥原料的C/N 调整为25∶1；调节堆肥物料的初始含水率，使其控制在50%～60%。所有堆肥均在总容积为32.5 L（100 cm×50 cm×65 cm）的发酵箱中进行，堆肥条件相同。在堆体温度降至环境温度(25±2)℃时开始堆肥，在堆肥期间，利用气泵对堆体进行供氧，保持通气量为600 mL/min。使用铁铲对堆体进行定期翻拌，保持良好通风条件。试验在静态堆肥下共进行60 d，根据堆肥过程中温度的变化，分别在堆肥第1、10、20、40、60 天采集样品。将堆肥时间分为升温阶段(1～10 d)、高温阶段（11～40 d）和腐熟阶段（41～60 d），采用五点取样法对堆体进行取样并混合均匀。堆肥物料基本理化指标见表1。

表1 堆肥物料基本理化指标Table 1 Basic physiochemical indexes of compost materials

1.3 基础理化指标测定

堆体温度使用温度传感器测定；堆肥样品pH 和电导率（EC）的测量按照堆肥样品∶超纯水为1∶10 的比例进行浸提，放于摇床上以150 r/min 振荡1 h，取过滤液，分别使用pH 计和电导率仪测定pH 和EC；采用差重法对堆肥含水率进行测定；采用燃烧法对堆肥有机质浓度进行测定，使用坩埚盛放2 g 堆肥鲜样品，放于105 ℃恒温干燥箱中4 h，称重，然后移入550 ℃的马弗炉中灼烧4 h，取出冷却至室温后称重；-N 和NH4+-N 浓度分别使用紫外分光光度法与纳氏试剂比色法测定；使用TOC 测定仪（multi N/C 3100 TOC/TC Analyzer，德国）对堆肥样品水溶性有机碳（DOC）浓度进行测定。

1.4 DOM 和HA 的提取

DOM 的提取参照文献[17]。堆肥样品风干后通过0.25 mm 的筛，取4 g 过筛后的样品放入50 mL 离心管中，按固液比1∶10 的比例加入40 mL 去离子水。在室温下振荡24 h，充分摇匀后，以8 000 r/min 离心20 min，取离心后的上清液过0.45 µm 滤膜，即为提取的DOM。

HA 的提取参照Wu 等[18]方法，首先配置0.1 mol/L 的NaOH 与0.1 mol/L 的Na4P2O7的混合液(体积比1∶1)，取4 g 过筛后的堆肥样品放入100 mL 的离心管中，按照固液比1∶20 的比例加入80 mL 的NaOH 与Na4P2O7的混合液，在室温下以180 r/min 浸提12 h，然后在4 ℃、10 000 r/min 条件下离心20 min，取上清液过0.45 µm 的滤膜，即为提取的HA 溶液。

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1.5 DOM 和HA 光谱分析

采用日立HF-7000 型荧光光谱测定仪测定DOM和HA 的三维荧光光谱，参数设置参考文献[19]，设置发射波长（Em）为280～550 nm，激发波长（Ex）为200～400 nm，PMT 电压为700 V，扫描频率为2 400 nm/min，间隔5 nm。为避免内滤效应的干扰，测定前将DOM 和HA 溶液的总有机碳(TOC)用去离子水稀释至10 mg/L[20]，调整浓度后的样品溶液在1 cm的石英池中用HF-7 000 荧光分光光度计扫描荧光光谱，以蒸馏水作为空白对照。

1.6 数据分析

采用荧光光谱软件FL WinLa 对原始数据进行初步处理，利用MATLAB 2020 软件中的Removescatter工具包进行散射处理，再利用DomFluor 工具包对其进行平行因子分析。利用2D-shige 软件对平行因子分析结果中的Emission Loading 进行二维相关光谱分析。采用Origin 2021 软件对荧光光谱指数进行计算，具体计算方法参考文献[21]。利用SPSS 26 软件进行单因素方差分析(one-factor analysis of variance，ANOVA)，采用R 语言进行相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 堆肥样品基础理化特性

对堆肥过程中各阶段样品理化指标进行差异性分析，如表2 所示。在整个堆肥过程中，pH 和NH4+-N浓度均先增加后降低，而-N 浓度持续增长。研究表明，在堆肥升温阶段含氮有机物被微生物分解转化为NH4+-N[22]，因而导致其浓度增加并伴随着pH 升高。随着堆体温度的升高以及pH 的增加，致使NH4+-N 以NH3的形式挥发出堆体，NH4+-N 浓度下降，以往的研究表明，NH4+-N 浓度的降低是堆肥逐渐腐熟的标志[23]；而同时高温期（≥40 ℃）会抑制硝化细菌的活性[24]，此阶段-N 浓度增加较为缓慢。腐熟期温度开始下降，NH4+-N 浓度持续降低，降温后硝化细菌活性逐渐增强，NH4+-N 在硝化细菌的硝化作用下转化为-N，进而导致-N 浓度增加，NH4+-N 浓度降低，pH 下降。

表2 堆肥样品理化特性Table 2 Physiochemical properties of compost samples

相同堆肥条件下，温度、pH 和NH4+-N 浓度表现为CM（CMB）＞FW；-N 浓度表现为FW＞CM（CMB），不同堆肥物料理化特性存在差异，进而导致CM、CMB 和FW 中含有的营养元素如C、N、P 等的浓度不同，CM 和CMB 堆肥的NH4+-N 浓度要显著高于FW 堆肥组，而FW 堆肥中-N 浓度较高。CM 和CMB 堆肥NH4+-N 浓度下降率大于FW 堆肥，由于CM 和CMB 为弱碱性物料，特别是添加菌剂的CMB 堆肥组，有利于进行氨氧化反应，而FW 物料呈弱酸性，有利于硝化反应的进行[25-26]，致使-N 浓度大于CM 和CMB 堆肥组。

由图1 可知，不同物料堆肥DOM 和HA 中DOC 浓度均随着堆肥的进行持续下降。堆肥前期DOC 作为碳源供微生物生长繁殖，堆肥腐熟期，由于部分有机质发生化学分解，进而导致DOC 浓度持续下降[27]。同种物料堆肥HA 中DOC 浓度均大于DOM，说明提取方法对有机质中DOC 浓度影响较大，碱性环境更有助于DOC 的浸出[28]，3 种堆肥DOM 或HA 中DOC 浓度均表现为FW＞CM＞CMB，FW 本身所含有的有机质较CM 和CMB 堆肥组的高，营养元素较为全面，DOC 浓度较高；CMB 处理组中芽孢杆菌的添加有助于提高微生物群落多样性，进而增强对DOC 的利用率。

图1 3 种堆肥DOM 和HA 中DOC 浓度变化Fig.1 DOC concentration changes of DOM and HA in three composts

2.2 堆肥三维荧光光谱特性

2.2.1 堆肥DOM、HA 荧光光谱特征参数

荧光光谱参数是表征堆肥DOM 和HA 物质特征与结构组成的重要手段。为探讨堆肥DOM 与HA 的结构特性的差异，对3 种堆肥样品提取的DOM 和HA 的荧光光谱参数进行分析，结果如表3所示。一般情况下，荧光指数（FI）定义为样品Ex 在370 nm、Em 在470 和520 nm 处的荧光强度的比值(f470/520)；自生源指数（BIX）定义为样品Ex 在310 nm、Em在380 与430nm处的荧光强度的比值(f380/430)；腐殖化指数（HIX）定义为样品Ex在254 nm、Em 在435～480 nm 与300～345 nm 处荧光强度平均值的比值[29]。FI 可用来反映堆肥DOM 的来源，通常与芳香性程度呈负相关[30]，BIX 可反映自生源DOM 占整体DOM 的比例[31]，HIX 可用于判别有机质的腐殖化程度[32]。由表3 可知，3 种堆肥DOM 的FI 和BIX 均值均大于HA，说明3 种堆肥DOM 的自生源特征较HA 明显，而HA 的自生源贡献率较低，不同提取方法影响了有机质的结构组成，进而影响了其光谱特性。至堆肥结束，3 种堆肥DOM 的FI 介于1.4～1.9，BIX 介于0.8～1.0[33]，说明3 种堆肥处理的DOM 来源同时受自生源和外生源的影响，且自生源特性较强；3 种堆肥处理的自生源特性表现为FW＞CM＞CMB，FW 堆肥自生源特性更强，表明FW 堆肥的DOM 更多地由微生物分解作用所产生。且3 种堆肥处理的FI 与BIX 在整个堆肥过程中均呈下降趋势，HIX 呈逐渐上升趋势，说明堆肥促进了腐殖质物质的形成。本研究中DOM 与HA 的HIX 分布在0.182～0.427 和0.417～0.687，其均值分别为0.280 和0.553，可知HA 的腐殖化程度大于DOM。DOM 是用纯水直接提取的，其溶解的总有机质浓度较少，而HA 是在碱性环境中提取的有机质，HA 结构的不饱和度随着堆肥时间的延长而增高，分子量及芳香度升高，不易被微生物代谢利用，物质组分及化学性质更为稳定[34]。3 种堆肥DOM 的HIX 表现为CMB＞CM＞FW，表明鸡粪堆肥可显著提高其腐殖化进程；且CMB 堆肥组的腐殖化特征更为显著，这与周可等[35]的研究结果较为一致。

表3 堆肥DOM、HA 的荧光光谱参数Table 3 Fluorescence spectrum parameters of compost DOM and HA

2.2.2 堆肥DOM、HA 荧光组分特征

为研究堆肥样品的DOM 与HA 的结构组成的差异，采用三维荧光平行因子分析法对不同堆肥处理的荧光光谱数据进行处理，如图2 所示。从图2可以看出，FW 的DOM 以及CM、CMB 的HA 均得到3 种荧光组分。根据文献[36-38]，组分C1 代表类酪氨酸，分子质量较小，对应峰B。组分C2 代表类色氨酸，与官能团羧基有关，短波/长波类色氨酸分别对应峰T1/T2，C1 和C2 均为易被微生物分解利用且聚合度较低的类蛋白物质。组分C3 代表类富里酸，紫外光区类富里酸对应峰A，由相对分子质量高且难降解的有机物组成，可见光区类富里酸对应峰C，由相对分子质量较低且易被分解氧化的有机物组成，属于类腐殖质物质。而CM、CMB 的DOM 以及FW 的HA 均得到4 种荧光组分，其中前3 种荧光组分同与上述相同，第4 种组分C4 为类胡敏酸，相对分子质量较大，对应峰F，含多环芳烃及苯环，与木质素的分解有关，C3 和C4 同属于类腐殖质物质。综上所述，3 种堆肥处理的荧光组分类型为类蛋白物质（类酪氨酸和类色氨酸）、类富里酸和类胡敏酸，这一结果与Xu 等[39]的研究结果较为一致。

图2 不同物料堆肥中DOM 和HA 的三维荧光组分Fig.2 Three-dimensional fluorescence components of DOM and HA in compost of different materials

为探究不同物料堆肥过程中DOM 和HA 的荧光组分随堆肥时间的变化特征，基于EEM-PARAFAC分析，对不同堆肥处理的各荧光组分进行分析（图3）。根据图3 可知，3 种堆肥提取的DOM 中，整体上类蛋白物质占比表现为FW＞CM＞CMB，类腐殖质物质占比表现为CMB＞CM＞FW，可见CM 和CMB 堆肥的腐殖化程度大于FW 堆肥，且CMB 堆肥组腐殖化程度更高，这与2.2.1 节荧光参数变化规律较为相似。在堆肥前期，3 个堆体的类蛋白物质占主体地位，且类酪氨酸组分占比最高，随着堆肥时间的延长，其占比逐渐下降，而类富里酸组分占比逐渐上升，FW 堆肥组的类蛋白物质的占比高于CM 和CMB 堆肥组。研究表明，类酪氨酸等蛋白类物质易被微生物降解并被转化为分子量较大、结构较为稳定的类腐殖质物质[40]。在堆肥试验结束时，3 组堆肥物料的芳香性及其腐殖化程度均有所升高，类腐殖质物质的占比增加，此外，FW 堆肥组类蛋白物质仍占主体地位，CMB 堆肥组的类腐殖质物质占比最高。

图3 不同物料堆肥DOM、HA 荧光组分占比变化Fig.3 Changes in the proportion of fluorescence components of DOM and HA in composts with different materials

随着堆肥时间的延长，HA 与DOM 类蛋白物质逐渐减少以及类腐殖质物质逐渐增加表现出相似的规律，但总体上HA 的类腐殖质物质占比要大于DOM 的。HA 中，3 种堆肥的类蛋白物质占比表现为CM＞CMB（FW）；类腐殖质物质表现为CMB(FW)＞CM，CMB 和FW 堆肥组的腐殖化程度要大于CM，且FW 堆肥组提取的HA 中观察到类胡敏酸组分。整体来说，3 种堆肥提取的HA 的类腐殖质占比要高于DOM。CM 和CMB 堆肥在较高的pH 环境下，可能由于水合离子及分子间发生了解离平衡的改变，导致CM 和CMB 堆肥提取的HA 中酸性官能团发生了变化[36]，进而影响HA 的大分子类胡敏酸物质的溶出。而FW 富含酸性有机组分，且有机质在分解过程中会产生大量有机酸，在提取FW 中HA 的同时，酸性组分易溶于碱性环境中，致使FW 中HA 的类腐殖质物质的占比要大于DOM。进一步对比发现，CMB 堆肥的DOM 与HA 中的类蛋白组分的减少量远高于CM 和FW，说明添加菌剂后鸡粪堆肥中微生物群落的改变使得DOM 中类蛋白物质更易被转化为较为稳定的类腐殖质物质。

2.2.3 堆肥过程DOM、HA 二维相关光谱

二维相关光谱(2DCOS)是一种分析有机质结构及其动态过程的有效解析方法[33]，使用2DCOS 可以通过沿二维扩展光谱来区分重叠峰，并提供有关分子结构变化的相对方向和顺序的信息，本研究根据平行因子结果中的Em Loading 进行二维相关光谱分析[36]，比较了不同堆肥中DOM 和HA 各荧光组分的演化时序，如图4 所示。在堆肥DOM 中，CM 同步2DCOS 中共观察到3 个自动峰（450 nm/450 nm、375 nm/375 nm、305 nm/305 nm）和2 个负交叉峰（450～500 nm/375 nm、350～430 nm/335 nm），CMB组观察到3 个自动峰（450 nm/450 nm、330 nm/330 nm、305 nm/305 nm）和1 个负交叉峰（375 ～450 nm/330 nm），FW 组观察到3 个自动峰（425 nm/425 nm、330 nm/330 nm、305 nm/305 nm）和2 个负交叉峰（425 nm/330 nm、375 nm/300 nm）。3 种堆肥DOM 的异步2DCOS 图谱具有显著性差异，在CM中观察到1 个负交叉峰（450 nm/325 nm）和2 个正交叉峰（425 nm/375 nm、375 nm/325 nm），在CMB 中观察到1 个负交叉峰（475 nm/305 nm）和2 个正交叉峰（450 nm/350 nm、350 nm/305 nm），在FW 中观察到2 个负交叉峰（425 nm/330 nm、350 nm/300 nm）和1 个正交叉峰（400～450 nm/300 nm）。根据Noda解析谱峰响应的顺序规则[41]，CM 组和CMB 组堆肥过程中观察到的DOM 各组分变化时序为类胡敏酸（Em=475 nm）＞类酪氨酸（Em=305 nm）＞类色氨酸（Em=355 nm）＞类富里酸（Em=425 nm）；FW 中DOM 的各组分变化顺序为类色氨酸（Em=350 nm）＞类酪氨酸（Em=300 nm）＞类富里酸（Em=425 nm）。由此可知，CM 和CMB 堆肥与FW 堆肥物质结构演化差异较大：CM 和CMB 堆肥中DOM 的大分子类胡敏酸物质先发生变化，可能是由于大分子腐殖质物质中包含苯环及多环芳烃，与木质素的降解息息相关[42]，而CM 和CMB 堆肥中含有大量纤维素，进而导致其组分浓度优先发生变化；FW 含有羧酸、多糖类等一系列低分子化合物组成，在堆肥过程中，微生物所分泌的蛋白酶优先分解利用小分子蛋白类物质[40]。因此，大分子类腐殖质物质的生成可能与类蛋白的分解有关，这与Li 等[43]的研究结果类似，聚合程度较低的类蛋白物质在微生物的分解利用下被转化生成聚合程度较高的大分子类腐殖质物质。

图4 不同物料堆肥DOM、HA 的二维相关光谱Fig.4 Two-dimensional correlation spectra of DOM and HA in composts of different materials

CM 和CMB 中HA 各组分演化时序为类酪氨酸（Em=305 nm）＞类富里酸（Em=425 nm）＞类色氨酸（Em=350 nm）。FW 中HA 各组分变化顺序为类胡敏酸（Em=475 nm）＞类酪氨酸（Em=305 nm）＞类色氨酸（Em=330 nm）＞类富里酸（Em=425 nm）。DOM 和HA 的腐殖化与堆肥过程中有机物的分解及组分浓度的变化密切相关。由于HA 是球形固体团块组成，结构较为稳定，而FW 中高分子有机化合物浓度较高，部分腐殖质结构可能在高pH 提取环境下被破坏，芳香化合物的荧光强度在短波长处增高[44]，导致FW 堆肥中HA 的大分子类胡敏酸优先变化[45]。

2.2.4 堆肥DOM、HA 结构变化影响因素

为探究不同物料堆肥过程中提取DOM 和HA物质组成和结构变化的影响因素，对堆肥DOM 与HA 的各荧光组分、荧光特征参数和堆肥基本理化指标进行相关性分析，结果如图5 所示。堆肥理化因子是影响DOM 和HA 结构演化时序的重要影响因素[43]，CM 和CMB 堆肥生成的DOM 中，NH4+-N浓度、含水率和DOC 浓度与类蛋白组分呈显著正相关（P＜0.05），含水率过高容易形成厌氧环境，不利于好氧微生物的生长代谢，使微生物群落结构发生改变，进而影响堆肥腐殖化进程[46]。-N浓度与HIX、类富里酸、类胡敏酸组分呈显著正相关（P＜0.05），有研究表明[47]N 元素对堆肥腐殖化与芳构化有显著促进作用，-N 通过调节微生物代谢活性，可能会促进堆肥大分子类腐殖质物质的形成。DOM 中，CM 和CMB 堆肥荧光特性对理化指标响应更为强烈。DOC 是活性较高的有机组分，是微生物生长的重要碳源，可通过缩聚作用或被微生物分解利用生成高分子稳定的类腐殖质物质，其分解转化可反映堆肥腐殖化进程[48-49]；HA 中，3 组物料堆肥类腐殖质物质的生成均与DOC 浓度的下降密切相关，说明DOC 浓度的下降可能与类蛋白物质的分解转化及大分子类腐殖质物质的形成有关。含水率的变化对FW 堆肥DOM 和HA 中类蛋白和类腐殖质物质的转化影响较大，这与堆肥物料本身特性有关，不同物料堆肥的结构演化时序对理化因子响应不同：CM 和CMB 的含水率较低，呈弱碱性，其所含有的木质纤维素具有高度的芳构化，可通过水解直接参与HA 的形成，促使大分子类腐殖质物质的形成。而FW 含水率较高，且含有卤代烃、羧酸、芳香醚等低分子化合物[50]，随着有机物的降解，小分子物质通过缩合反应聚集形成具有腐殖质特征且结构复杂的大分子化合物；此外，FW 富含酸性有机组分，在分解过程中产生大量小分子有机酸，易溶于碱性环境中，逐渐表现出类腐殖质成分的特征，从而增加了FW 中HA 的结构稳定性，由此导致不同物料堆肥DOM 和HA 结构变化的影响因素存在差异。

图5 堆肥DOM、HA 荧光特征与理化性质的相关性分析Fig.5 Correlation analysis between fluorescence characteristics and physicochemical properties of DOM and HA of compost

3 结论

（1）堆肥DOM 和HA 的三维荧光特征参数的差异显著。随着堆肥时间的延长，3 种堆肥处理的NH4+-N 浓度呈先增加后降低的趋势，-N 浓度后期缓慢增加；3 种堆肥的DOM 与HA 均具有自生源特性，DOM 的自生源特征强于HA，HA 的腐殖化程度较高。DOC 浓度表现为HA 高于DOM，堆肥过程中DOC 被不断消耗利用而逐渐降低，DOM 或HA 中DOC 浓度均表现为FW＞CM＞CMB。

（2）3 种堆肥提取的DOM 中，CM 和CMB 的腐殖化程度大于FW；3 种堆肥提取的HA 中，CMB 和FW 的腐殖化程度大于CM。HA 的类腐殖质物质相对浓度大于DOM 的，且在FW 提取的HA 中观察到类胡敏酸组分。

（3）不同物料堆肥提取DOM、HA 荧光组分演化顺序不同。DOM 中，CM 和CMB 堆肥过程中观察到的各组分变化顺序为类胡敏酸＞类酪氨酸＞类色氨酸＞类富里酸。FW 中各组分变化顺序为类色氨酸＞类酪氨酸＞类富里酸。HA 中，CM 和CMB 中各组分变化顺序为类酪氨酸＞类富里酸＞类色氨酸。FW 中各组分变化顺序为类胡敏酸＞类酪氨酸＞类色氨酸＞类富里酸。

（4）堆肥DOM、HA 的结构组成演变的影响因素存在差异且不同物料堆肥的结构变化对理化因子响应不同。含水率、NH4+-N 浓度的下降可能是驱动DOM 中类蛋白物质的降低、增强腐殖化程度的重要影响因素；类腐殖质物质的增加与-N 浓度的升高有关，含水率和DOC 浓度降低可能会促进HA 类腐殖质物质的增加。