纳米二氧化钛与磷互作对莱茵衣藻砷累积与生物转化的影响

张鑫，杨帆，于子悦，颜昌宙*

1.中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室

2.中国科学院大学

砷（As）是一种广泛存在于水、大气、土壤、岩石和生物体的有毒类金属，被世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构（IARC）定级为一类致癌物质。As 在天然水体中的浓度范围很大，从小于0.5 µg/L到大于5 000 µg/L 不等，在地表富氧水体中主要以砷酸盐〔As(Ⅴ)〕的形态存在[1]。越来越多的证据表明，即使是在较低的As 暴露水平（10 µg/L）下也会对人体健康产生影响[2]。藻类修复是一种绿色、低成本、可持续的水环境污染原位生物修复方法。浮游藻类细胞壁具有较大的表面积与黏性，可提供多种官能团与As 结合，使其可有效地吸附和富集As 等离子[3]。李妍丽[4]研究了5 种淡水绿藻对As 污染水体的生物修复，发现1.0×107个/mL 藻细胞作用24 h后As(Ⅴ)（1 mg/L）的去除率为68.35%～85.45%，该研究还指出微藻在As(Ⅴ)修复过程主要涉及细胞表面官能团，如羧基、氨基、羟基、磺酸基等。此外，微藻还能通过甲基化等途径对As 进行代谢转化[5]，甲基化的As 还可以继续转化成为毒性相对较低的有机砷，如砷糖和砷脂等[6]，因而微藻在水体As 污染修复中具有很大的潜力。然而，自然水环境是一个非常复杂的体系，大部分As 与环境中的各种颗粒物（纳米颗粒、腐殖酸等）共存。由于环境物质可能会通过与As 竞争在微藻表面的结合位点[7]、影响细胞膜的渗透性[8]等方式改变As 在藻-液界面的物理化学行为，进而调控As 在藻细胞中的吸附、吸收与形态转化过程。因此，探究环境物质包括纳米颗粒对微藻As 吸收转化的调控作用，对于系统了解微藻对As 的代谢机制及其生态修复功能，具有十分重要的理论价值和现实意义。

纳米二氧化钛（nano-TiO2）因其独特的理化性质在水处理、造纸、纺织等行业中得到广泛应用。预计到2025年，nano-TiO2的年产量约为250 万t[9]，这将使其不可避免地暴露于水环境中。根据预测调查，地表水和废水中nano-TiO2浓度为15 ng/L～16 µg/L，高暴露情境下地表水中nano-TiO2浓度可以达到mg/L 级别[10-12]。nano-TiO2因其较大的比表面积与吸附能力，能作为载体促进As 在水生生物（鲤鱼[13]、大型蚤[14]、丰年虾[15]）中的摄入，并调控生物对As 的排泄与利用。针对浮游藻类的研究也发现类似的现象，如Luo 等[5]的研究表明，添加nano-TiO2后铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）和斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）对As 的累积和甲基化作用显著增加。Yang 等[16]研究发现，nano-TiO2与As(Ⅴ)共暴露24 h 后，As 在拟微绿球藻（N. maritima）细胞碎屑组分中的分布显著增加，而在细胞器组分中的占比却显著降低，该研究认为细胞壁对纳米颗粒的拦截效应降低了As 对微藻的毒性作用。但是，目前关于nano-TiO2如何影响微藻As 累积与生物利用方面的研究仍相对较少，尤其是As 的代谢转化方面，相关调控机理的揭示仍比较零散，缺乏系统性，有待开展深入研究。

笔者以模式生物——莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）为研究对象，以PO43-为限制性条件，采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）分析藻细胞中As 的累积量以及培养基和藻细胞中As 形态，研究nano-TiO2存在与否条件下，莱茵衣藻对As(Ⅴ) 累积代谢差异，探究nano-TiO2对莱茵衣藻As(Ⅴ)累积和生物转化的调控作用，以期为应用微藻修复As 污染水体提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究用nano-TiO2为锐钛矿晶型，其粒径小于25 nm，纯度大于99.7%，购于Sigma-Aldrich 公司。将nano-TiO2粉末分散于超纯水中，配制成1 g/L 的储备液，冰浴超声30 min 后于4 ℃避光保存。试验前，将储备液稀释至2 和20 mg/L，冰浴超声30 min后待用。

采用Na3AsO4·12H2O (国药集团化学试剂有限公司)配制1 mmol/L 的As(Ⅴ)储备液，试验前稀释至10 µmol/L。

1.2 藻种及培养条件

莱茵衣藻购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，在TAP 培养基（pH=7.0）中悬浮培养，培养温度为25 ℃，光照强度为2 000 lx，光暗比为12 h∶12 h。藻种扩增及培养过程中均采用无菌操作。

1.3 nano-TiO2沉降动力学及对As(Ⅴ)的吸附

采用紫外-可见光分光光度法监测nano-TiO2在不同PO43-浓度TAP 培养基中的动力沉降过程[17]：在nano-TiO2浓度为2 和20 mg/L 纳米混悬液冰浴超声后的0、1、2、4、6、12、24、36、48 h，吸取适量样品在370.5 nm 处测定样品吸光度，以吸光度的变化表征nano-TiO2在不同PO43-浓度TAP 培养基中的动力沉降过程。

将As(Ⅴ)和冰浴超声分散后的nano-TiO2添加到不同PO43-浓度的灭菌TAP 培养基中，使培养基中As(Ⅴ) 终浓度为10 µmol/L，nano-TiO2终浓度为2 和20 mg/L，体系pH 调至7.0 后密闭置于恒温振荡培养箱（25 ℃、175 r/min）中，于0、1、2、4、6、12、24、48 h 取适量样品，12 000 g 离心10 min，稀释、过滤后，使用ICP-MS 测定上清液中As 浓度，通过其变化特征分析计算不同PO43-浓度下nano-TiO2在TAP 培养基中对As(Ⅴ)的吸附。

nano-TiO2在不同PO43-浓度TAP 培养基中对As(Ⅴ)的吸附率和吸附量计算公式如下：

式中：A为吸附率，%；B为吸附量，µg/mg；V为溶液体积，L；C0为As(Ⅴ) 初始浓度，µg/L；Ce为吸附后As(Ⅴ)浓度，µg/L；m为nano-TiO2质量，mg。

1.4 莱茵衣藻试验设置

分别设置了1 个As(Ⅴ) 浓度（10 µmol/L），3 个nano-TiO2浓度（0、2、20 mg/L）和4 个磷酸盐（PO43-）浓度（0.013、0.1、0.5、1.0 mmol/L）进行交叉试验（表1）。PO43-浓度梯度设置，主要参考Zhang 等[18]的研究以及地表Ⅴ类水中PO43-浓度。通过高浓度的PO43-限制藻细胞对游离态As(Ⅴ)的吸收，比较莱茵衣藻对nano-TiO2结合态As(Ⅴ)、游离态As(Ⅴ)吸收与代谢的差异。

表1 试验分组设计Table 1 Experimental group design

将预培养至对数生长期的莱茵衣藻在4 ℃下于2 500 r/min 离心15 min，弃去上清液，用灭菌的无磷TAP 培养基清洗3 次，去除细胞表面吸附的PO43-。将藻细胞重新分散于无磷TAP 培养基中缺磷驯化3 d，以耗尽藻细胞内储存的PO43-，确保试验不受藻细胞内PO43-的干扰。将达到对数生长期的缺磷莱茵衣藻重悬于200 mL 灭菌TAP 培养基中，接种初始OD680为0.06（藻细胞密度约为1×105个/mL）。各试验组设置3 个重复，培养条件与预培养一致，每天手摇3 次以保证气体交换以及nano-TiO2颗粒与藻细胞充分接触。暴露周期为8 d，每天定时测定藻细胞生长密度，并于第1、4、8 天收集一定量的藻液，测定不同处理条件下生长初期、对数生长期和静止期莱茵衣藻对As 的累积，以及暴露结束时（第8 天）培养基和藻细胞中的As 形态。

1.5 总As 和As 形态分析测定

1.5.1 藻体总As 的测定

取一定量藻液于4 000 r/min、4 ℃下离心15 min 后收集藻细胞，用适量磷酸盐缓冲液〔1 mmol/L K2HPO4、0.5 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O 和5 mmol/L MES，pH 为6.0〕和超纯水清洗3 遍以去除莱茵衣藻细胞表面吸附的As。藻细胞冷冻干燥至恒质量后，取5 mg 左右冻干藻样加入纯HNO3-HF 混合液（二者比例为5∶1）共1.2 mL 于微波消解（程序为600 W、2 min；0 W、2 min；450 W、45 min），用2%HNO3定容，经0.22 µm水系过滤器过滤后，采用ICP-MS 测定样品中As 浓度。

1.5.2 培养基与藻细胞中水溶性As 形态的提取与测定

莱茵衣藻暴露8 d 后取一定量的藻液离心，上清液经0.22 µm 水系过滤器过滤后于-80 ℃保存，待测。藻细胞中As 形态的提取参照文献[19-20]的方法：称取一定量冷冻干燥后的藻样，加入2 mL 超纯水为萃取剂，冰浴超声萃取10 min（100 W、40 Hz）后4 000 r/min 离心5 min；重复提取3 次，将离心的上清液合并后定容，提取液经0.22 µm 水系过滤器过滤后于-80 ℃保存，待测。

培养基和莱茵衣藻藻细胞中的As 形态采用HPLC-ICP-MS 测定。将前置保护柱（11.2 mm，12～20 µm）与阴离子交换柱（Hamilton PRP-X100）串联，使用流动相〔10 mmol/L (NH4)2HPO4，10 mmol/L NH4NO3，pH 为6.25〕对各As 形态进行分离，同时配置不同浓度的As(Ⅲ)、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）和As(Ⅴ)混合标准溶液对样品中As 的形态与浓度进行鉴定与分析。检测条件：进样体积50µL，流速1.0 mL/min，运行时间10 min。

1.6 质量控制与数据统计分析

在总As 和As 形态的测定过程中，以45Sc、72Ge和103Rh 为内标元素，以As 的标准曲线进行定量。分析过程中每10 个样品对5.0 和20.0 µg/L As 标准样品进行回测，确保测试信号的稳定性和数据的准确性。总As、As(Ⅲ)、MMA、DMA 和As(Ⅴ) 的检出限分别为0.01、0.07、0.12、0.07 和0.20 µg/L。使用紫菜标准品（GBW08521，中国国家标准材料研究中心）进行质量控制，总As 提取回收率为107.18%±0.43%。

采用Origin 2021b 软件对数据进行处理和作图，运用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验PO43-和nano-TiO2共同作用下藻细胞密度、As 的累积和As 形态的差异，差异显著性水平设置为P＜0.05。所有统计数据均用平均数±标准偏差（mean±SD）表示。

2 结果与讨论

2.1 nano-TiO2在TAP 培养基中的沉降及对As(Ⅴ)的吸附

纳米颗粒在水体中存在团聚、沉降等环境行为，会影响其对水生生物的毒性效应。nano-TiO2在培养基中的保持率为吸光度与初始吸光度的比值。nano-TiO2的浓度对其在TAP 培养基中的沉降性能有着显著的影响。由图1 可知，试验结束时（48 h），20 mg/L 的nano-TiO2在TAP 培养基中的保持率（9.65%±0.87%～13.53%±1.69%）显著低于2 mg/L nano-TiO2（29.60%±0.71%～57.76%±1.14%），这与Brunelli等[21]的研究结果中初始浓度是影响nano-TiO2沉降的主要因素相符。由图1(a) 可知，随着PO43-浓度的增高，2mg/Lnano-TiO2在培养基中的保持率逐渐降低，Li等[22]研究发现nano-TiO2在淡水中的沉降速率与PO43-浓度呈正相关，说明PO43-会降低nano-TiO2在TAP 培养基中的稳定性，从而降低nano-TiO2与莱茵衣藻之间的接触机会。当nano-TiO2浓度为20 mg/L 时〔图1(b)〕，不同PO43-浓度对nano-TiO2在TAP 培养基中的保持率无明显影响，这也说明与溶液中的PO43-浓度相比，nano-TiO2的初始浓度是其沉降的主要影响因素。

图1 nano-TiO2在TAP 培养基中的保持率Fig.1 Retention rate of nano-TiO2in TAP medium

研究表明，nano-TiO2不仅对As 具有很强的吸附能力，还可能通过改变细胞表面特性影响藻类对As 的摄取以及影响微藻对As 后续的生物代谢[23-24]。nano-TiO2在不同PO43-浓度的TAP 培养基中对As(Ⅴ)的吸附如图2 所示。nano-TiO2对As(Ⅴ)的吸附分为快速吸附和吸附平衡2 个阶段。nano-TiO2浓度相同时，由于PO43-与As(Ⅴ) 的相似性，PO43-会与As(Ⅴ) 竞争nano-TiO2上的结合位点，nano-TiO2对As(Ⅴ)的吸附率随PO43-浓度的升高而降低。当达到吸附平衡时，2 mg/L nano-TiO2在不同PO43-浓度TAP 培养基中对As(Ⅴ) 的吸附率为6.92%±0.60%～18.10%±2.27% ， 吸附量为(2.60±0.22)～(7.04±0.88) µg/mg ； 20 mg/L nano-TiO2对As(Ⅴ)的吸附率显著高于2 mg/L，吸附率为19.25%±1.28%～35.31%±1.08%，吸附量为(0.69±0.05)～(1.23±0.04) µg/mg。采用准一级和准二级动力学方程来预测吸附过程的机理，公式如下：

图2 nano-TiO2在TAP 培养基中对As(Ⅴ)的吸附率及吸附量Fig.2 Adsorption rate and adsorption capacity of As(Ⅴ) of nano-TiO2in TAP medium

准一级动力学方程

准二级动力学方程

式中：t为吸附时间，min；qt为t时刻nano-TiO2对As(Ⅴ)的吸附量，mg/g；qe为吸附平衡时，nano-TiO2对As(Ⅴ) 的吸附量，mg/g；k1为准一级动力学方程速率常数，g/(mg·min)；k2为准二级动力学方程速率常数，g/(mg·min)。

从表2 可知，准一级动力学与准二级动力学均能较好地拟合nano-TiO2在不同PO43-浓度的TAP培养基中对As(Ⅴ)的吸附过程，但是准二级动力学的R2大于准一级动力学，对该过程的描述相对更为精准，这说明，nano-TiO2对As(Ⅴ)的吸附速率受化学吸附控制，Wagle 等[25-26]的研究也得到类似的结果。

表2 不同条件下的吸附动力学参数Table 2 Adsorption kinetic parameters under different conditions

2.2 nano-TiO2和PO43-互作对莱茵衣藻生长的影响

不同浓度PO43-对莱茵衣藻藻密度影响随时间变化如图3 所示。从图3 可知，在8 d 的培养期内，P0.5T0和P1.0T0处理组藻密度没有明显差异，但是随着PO43-浓度的降低（P0.1T0和P0.013T0处理组）莱茵衣藻生长受到显著抑制。试验后期（5 ～8 d），P0.1T0和P0.013T0处理组藻密度仅有P1.0T0处理组的77.01%～84.00% 和17.00%～20.86%。这可能是因为PO43-为微藻生长必需的营养盐，充足的PO43-有利于藻细胞的生长。在PO43-浓度为0.1、0.5 mmol/L时，与无nano-TiO2添加组相比，2 mg/L nano-TiO2暴露对莱茵衣藻生长没有显著影响，2 个处理组藻密度没有显著性差异（P＞0.05）；但随着nano-TiO2浓度增至20 mg/L，P0.1T20和P0.5T20处理组生长受到显著抑制〔图3(b)、图3(c)〕，其藻密度仅是无nano-TiO2添加组的81.96% 和74.27%。研究表明[23,27]，nano-TiO2团聚物会附着在藻细胞表面，这可能会减少被包裹的藻细胞所能获得的光和养分，从而抑制其生长。Chen 等[23]还发现nano-TiO2在莱茵衣藻藻细胞表面的团聚作用呈现剂量效应，浓度越高团聚体数量越多。这也在一定程度上解释了本研究中nano-TiO2浓度与藻生长所受抑制之间的关系。而对P0.013T20组而言，高浓度nano-TiO2（20 mg/L）与相对低PO43-浓度（0.013 mmol/L）共同作用，使得莱茵衣藻在试验初期就停止了生长，因此图表中无P0.013T20试验组数据。但P1.0T20处理组藻细胞的生长并未受到nano-TiO2浓度升高的影响〔图3(d)〕，这可能是因为充足的PO43-促进了藻细胞的生长，减轻nano-TiO2对藻细胞抑制作用。

图3 不同PO43-及nano-TiO2浓度下莱茵衣藻的藻密度变化Fig.3 Density changes of Chlamydomonas reinhardtii under different concentrations of PO43- and nano-TiO2

2.3 nano-TiO2与PO43 -互作对莱茵衣藻As 累积效果的影响

不同处理下莱茵衣藻细胞不同生长阶段对As 的累积如图4 所示。由图4 可知，暴露初期（第1 天），P0.013T0、P0.1T0处理组莱茵衣藻As 累积量为分别为（40.34±6.68）和（50.21±2.94）µg/g，显著高于P0.5T0和P1.0T0处理组〔（12.89±0.98）和（21.61±5.56）µg/g〕（P＜0.05）。经饥饿处理的微藻恢复到适宜生长的条件后，由于超补偿效应会显著增加对营养盐的吸收[28]，且砷酸盐与磷酸盐有着相同的内化机制，能通过多种磷酸盐转运蛋白进入藻体[29]，因此在0.013 和0.1 mmol/L PO43-处理条件下，As(Ⅴ) 在与PO43-的竞争转运系统中占优势，同时藻细胞倾向于合成更多的磷酸盐转运蛋白以减轻磷限制[30-31]，进而促进了As 的累积。Wang 等[32]研究了不同PO43-浓度下杜氏盐藻对砷酸盐的累积动力学，亦发生类似的现象。而在第4、8 天，P0.013T0、P0.1T0处理组As的累积水平和变化规律与P0.5T0和P1.0T0处理组规律基本一致，这可能和微藻的超补偿作用随培养时间的延长而降低有一定的关系[33]。

图4 不同处理下莱茵衣藻细胞不同生长阶段对As 的累积Fig.4 As accumulation in Chlamydomonas reinhardtii cells at different growth stages in different treatments

Nano-TiO2的加入显著促进了第1 天0.013、0.1 和0.5 mmol/L PO43-处理条件下藻细胞对As 的累积，且随着nano-TiO2浓度的升高，藻细胞对As 的累积量也随之增加。尤其是0.013、0.1 mmol/L PO43-浓度下，P0.013T2处理组〔（99.62±14.57）µg/g〕的藻细胞As 累积量是P0.013T0处理组〔（40.34±6.68）µg/g〕的246.95%，P0.1T2〔（105.70±7.58）µg/g〕和P0.1T20〔（155.01±13.93）µg/g〕处理组的藻细胞As 累积量分别是P0.1T0处理组〔（50.21±2.94）µg/g〕的210.52%和308.72%。nano-TiO2对As 很强的吸附能力[26]，可作为载体促进藻细胞对As 的累积。Luo 等[34]在研究nano-TiO2对铜绿微囊藻和斜生栅藻As 生物利用和转化的影响中也发现了类似的结果。与PO43-浓度为0.013、0.1 和0.5 mmol/L 的处理组不同，1.0 mmol/L PO43-处理条件下nano-TiO2的载体效应暴露初期较低，这可能是因为高浓度 PO43-(1.0 mmol/L)条件下nano-TiO2对As 的吸附率较低（图2）、载体效应不明显所致。同时，研究表明，As(Ⅴ)、PO43-与nano-TiO2在藻细胞表面有着相同的结合位点（—COOH和—NH2）[35-38]。高浓度的PO43-（1.0 mmol/L）在一定程度上抑制了As(Ⅴ)、nano-TiO2在莱茵衣藻上的吸附，进而降低了纳米的载体效应，从而导致藻细胞对As 的累积量不高。

对数生长期（暴露第4 天），培养基中PO43-浓度为0.013 和0.1 mmol/L 时，P0.013T2处理组藻细胞中As 累积量〔（22.21±3.72）µg/g〕仅有第1 天累积量的22.29%，P0.1T2处理组藻细胞中As 累积量〔（26.02±3.95）µg/g〕仅有第1 天累积量的24.62%。这可能是因为随着培养时间的延长，nano-TiO2的载体效应呈降低趋势。李金丽等[39]的研究表明，nano-TiO2在SM7 培养基中迅速团聚成大颗粒并发生沉降。本试验结果也表明，48 h 后2、20 mg/L nano-TiO2在培养基中的保持率分别仅有29.60%～57.76%和9.65%～13.53%，这将不利于nano-TiO2颗粒携带As 进入藻细胞。微藻因其较大的比表面积及较多的官能团，可以吸附、吸收水环境中的金属离子和纳米颗粒而被广泛应用于水处理中。从本试验的结果来看，在0.013、0.1 mmol/L PO43-浓度下，nano-TiO2持续暴露1 d 均能有效促进藻细胞对As 的吸收与吸附。其中，0.1 mmol/L PO43-条件下微藻能耐受更高浓度的nano-TiO2（20 mg/L），且获得更高的累积量。但是，0.1 mmol/L PO43-显著高于自然环境下PO43-浓度，在去除As 污染的同时可能会增加水体磷负荷。因此，在应用微藻和纳米材料处理As 污染水体时，应合理设置PO43-浓度以及藻细胞、纳米材料和As 作用时间，以获得最佳的As 去除率。

2.4 nano-TiO2与PO43-互作对莱茵衣藻As 生物转化的调控作用

不同处理下莱茵衣藻细胞中各As 形态占比如图5 所示。由图5 可知，培养8 d 后，P0.1T0、P0.5T0和P1.0T0处理组藻细胞内检测到的水溶性As 有As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和DMA，但是P0.013T0处理组仅检测到As(Ⅴ)，这可能是因为缺磷条件下藻细胞膜的完整性水平降低[40]，As(Ⅴ)还原生成的As(Ⅲ)更易排出藻细胞所致。Wang 等[41]研究了不同PO43-浓度下铜绿微囊藻对As 的吸收和净化，也发现低磷条件下藻细胞中As 的外排速率显著高于富磷条件。

图5 不同处理下莱茵衣藻细胞中各As 形态占比（第8 天）Fig.5 Percentage of As speciation in Chlamydomonas reinhardtii cells in different treatments (Day 8)

值得注意的是，添加nano-TiO2后，PO43-浓度为0.1、0.5 和1.0 mmol/L 的处理组中藻细胞内除As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和DMA 外还检测到一种未知As 形态(图5)。根据张金羽等[19,42]的研究，该未知的As 形态是含氧砷糖的一种——磷酸砷糖（phosphate arsenosugar）（图6）。这表明nano-TiO2的存在，使得As(Ⅴ)在莱茵衣藻细胞中的生物转化途径发生了转变。Miyashita 等[43]研究发现脂溶态砷化物——磷脂酰砷糖的基本结构中包括甘油砷糖和磷酸砷糖，并指出砷糖可能是合成砷脂的前体化合物。Ender 等[44]认为砷糖能实现某些基本的细胞功能，比如结合到细胞膜结构中。纳米颗粒能够通过大量积累活性氧（ROS）、物理化学作用或酶活性调节破坏细胞磷脂双分子层结构[45]，导致磷脂降解，降低细胞膜的完整性、流动性和选择性。nano-TiO2与细胞膜相互作用可能会促进某些酶的表达（arsM 等[46]），进而促进莱茵衣藻砷糖的生物合成。而且在nano-TiO2浓度相同时，随着PO43-浓度的降低，藻细胞内砷糖所占的比例逐渐增加(图5)。Glabonjat 等[47]的研究也得到类似的结果，富磷条件导致PicocystisML 菌株砷糖下调，反之上调。这在一定程度上印证了nano-TiO2和磷限制处理可以促进藻细胞合成含氧砷糖等化合物来代替实现PO43-的功能这一推测。与PO43-浓度为0.1、0.5 和1.0 mmol/L 的处理组不同，P0.013T2组藻细胞内仅检测到As(Ⅴ) 和As(Ⅲ)，这可能是因为nano-TiO2和缺磷共处理使莱茵衣藻生长受到抑制，无法进行无机As 的甲基化。

图6 不同形态As 的HPLC-ICP-MS 谱图Fig.6 HPLC-ICP-MS spectra of As species

2.5 nano-TiO2与PO43 -互作对莱茵衣藻As 外排的调控作用

莱茵衣藻可以对As(Ⅴ)进行吸收、转化以及外排。经过8 d 的暴露，培养基中主要检测到的As 形态为As(Ⅴ)和As(Ⅲ)，0.1和0.5 mmol/LPO43-处理组中还有少量DMA（图7）。Guo 等[48]的研究也发现铜绿微囊藻在磷有限和富磷条件下培养基中仅观察到DMA 和无机砷。笔者认为这可能是因为MMA只是作为As(Ⅴ) 生物转化的中间体被迅速转化为DMA[49]，也说明DMA 这种甲基砷形态在As 的生物转化中的优势。

图7 不同处理下培养基中各As 形态占比（第8 天）Fig.7 Percentage of As species in culture medium of different treatments (Day 8)

PO43-浓度对培养基中As 的形态有很大影响。随着PO43-浓度从0.013 mmol/L 增至1.0 mmol/L，培养8 d 后单独的PO43-处理组培养基中As(Ⅲ)的浓度分别为（744.24±3.42）、（710.38±8.60）、（577.04±13.95）、（33.56±3.30）µg/L，分别占培养基中总As 浓度的99.19%、96.66%、87.10%和5.38%，呈显著下降趋势（图7）。Zhang 等[18]在研究不同PO43-浓度下蓝藻对As 的氧化还原时也发现了同样的现象。由于PO43-与As(Ⅴ)的结构类似，在微藻对As(Ⅴ)的吸收与吸附过程中存在竞争效应。随着PO43-浓度降低，藻细胞对As(Ⅴ)的吸收增加[18]，进而促进了As(Ⅲ)的还原与外排。研究表明[30]，莱茵衣藻对As(Ⅲ)的耐受性（EC50为132.2 mg/L）[50]高于As(Ⅴ)（33.5 mg/L）。因此，在0.013 和0.1 mmol/L PO43-浓度下，虽然培养基中As(Ⅲ)的浓度和占比显著提高，但是对莱茵衣藻生长没有显著影响。

与单独的PO43-处理组相比，nano-TiO2和PO43-共处理组培养基中As(Ⅲ) 占比和浓度随着nano-TiO2浓度的增加而降低，尤其是0.5 mmol/L PO43-浓度下，2 和20 mg/L nano-TiO2添加组培养基中As(Ⅲ)占比分别为44.99% 和30.76%，显著低于PO43-单独处理组（87.10%）。微藻能够将As(Ⅴ)在细胞内还原为As(Ⅲ)并进行甲基化，Xue 等[42]研究利用Synechocystissp. PCC6803 证明了DMA 参与砷糖的生物合成。细胞内的As 形态结果表明，nano-TiO2添加组砷糖为主要形态的As，这可能是由于其暴露细胞内还原的As(Ⅲ)作为底物参与砷糖的生物合成，而不是简单的外排。此外，Chen 等[51]将斜生栅藻暴露在2 mg/L的nC60 中，发现在各亚细胞组分中纳米颗粒在藻细胞壁（细胞碎屑中的一部分）中占比最高；Geitner 等[52]做了类似的研究，也观察到金纳米粒子主要分布于小球藻细胞壁组分中。这些研究结果均表明细胞壁是藻细胞阻挡纳米颗粒的主要屏障，进而抑制藻细胞对纳米结合态As(Ⅴ) 的吸收、还原与外排。而且，细胞壁对纳米材料的拦截作用在一定程度上也可以解释以下现象，即相同PO43-浓度下培养基中As(Ⅲ)占比随着nano-TiO2浓度的增加而降低，因为nano-TiO2对As(Ⅴ) 的吸附随纳米颗粒浓度的增加而增加。

3 结论

（1）莱茵衣藻生长受PO43-和nano-TiO2共同影响，0.013 mmol/L 的PO43-和20 mg/L 的nano-TiO2均能显著抑制藻细胞的生长。

（2）暴露初期（1 d），nano-TiO2的添加显著促进了PO43-浓度为0.013、0.1 和0.5 mmol/L 时藻细胞对As 的累积，且随着nano-TiO2浓度的升高，藻细胞对As 的累积量也随之增加。但是随着培养时间的延长，nano-TiO2的载体效应逐渐降低。因此，在应用微藻和纳米材料处理含As 废水时，应合理设置微藻、nano-TiO2和As 作用时间以获得最佳的去除率。

（3）当nano-TiO2存在时，进入藻细胞的As(Ⅴ)除了还原成As(Ⅲ)并甲基化生成DMA 外，还能转化为结构更复杂、毒性更低的砷糖；且随着PO43-浓度的降低，藻细胞内砷糖所占的比例逐渐增加，这可能会抑制As(Ⅲ)的外排。此外，nano-TiO2对As(Ⅴ)的吸附作用以及藻细胞壁对nano-TiO2的拦截作用也可能会抑制微藻对As(Ⅴ)的吸收，进而降低培养基中As(Ⅲ)的浓度。

（4）研究表明，纳米颗粒改变了As(Ⅴ)在莱茵衣藻藻细胞中的生物转化途径，但nano-TiO2介导下微藻As 吸收转化的分子机制还需要进一步研究。