城市污水处理厂抗生素抗性基因研究进展

张冰，赵琳，陈坦*

1.中央民族大学生命与环境科学学院

2.中央民族大学北京市食品环境与健康工程技术研究中心

抗生素是微生物的次级代谢产物，具有抑菌、灭菌的作用，自1928年发现青霉素以来，抗生素已广泛应用于医疗行业与生产生活中[1]。但抗生素的滥用、乱用导致微生物的耐药性持续提升，加剧环境中抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性细菌（ARBs）的广泛传播，严重威胁着人类健康与生态安全。由于ARGs 是ARBs 存在耐药性的根本原因，即使ARBs 死亡，携带ARGs 的裸露DNA 仍会长期存在于环境中，因此ARGs 在环境中的持久性残留、传播和扩散危害极大[2]。

城市污水处理厂已被证明是抗生素和ARGs 的重要“源”与“汇”。据估计，大约30%～60%的处方抗生素[3]以及畜牧养殖和医疗废水中的大量ARGs[4]在污水处理厂汇集，而活性污泥系统中较高的微生物浓度与多样性以及亚抑制浓度抗生素的选择压将进一步促进ARGs 和ARBs 的生成与传播。据报道，污水处理厂出水对下游水体ARGs 具有较高贡献[5]，污水处理厂中ARGs 的种类与丰度显著高于冻土与沉积物样品[6]以及淡水[7]、土壤[8]等环境介质。在某些地区，市政污水中的ARGs 种类和丰度显著高于医院废水[9]。现有的城市污水处理工艺主要针对COD、氨氮等常规污染物，对ARGs 的去除能力有限[10]，因此，如何有效去除ARGs 受到了全球学者的广泛关注。

1 基于文献计量的研究现状简述

为了解城市污水处理厂中ARGs 的相关研究进展与热点，分别以“Antibiotic resistance gene*/ARG*”+“Wastewater treatment plant*/WWTP*”为主题在Web of Science（WoS）以及以“抗性基因”+“污水”为主题在中国知网（CNKI）检索了2006年以来发表的相关论文。从2006年Pruden 等[11]提出ARGs 为新兴污染物开始，污水处理厂与ARGs 有关研究呈逐年上升的趋势，2013年进入快速上升阶段，与抗生素的研究趋势相近[12]。2006—2009年CNKI 仅报道了1 篇有关污水中ARGs 的论文，从2010年开始发文量才有所提升〔图1（a）〕。虽然CNKI 发文量整体偏少，但利用VOSviewer 将WoS 核心合集检索结果可视化后发现，以中国为发文国家的SCI 论文数量领先于其他国家和地区〔图1（b）〕，表明我国在有关污水处理厂ARGs 的研究中具有重要的国际地位。进一步梳理和归纳后可以发现，现有研究主要关注以下4 个方面：1）ARGs 在污水处理过程以及后续环境介质中的归趋；2）抗生素、重金属等污染物对ARGs 的选择压力与相互作用；3）ARGs 的传播扩散途径；4）影响ARGs 丰度、多样性和水平基因转移的主要环境因素。本研究也主要围绕这4 个方面展开综述。

图1 2006—2021年国内外有关污水处理厂ARGs 的发文统计Fig.1 Statistical charts of publications on ARGs in WWTPs at home and abroad from 2006 to 2021

2 城市污水处理厂中ARGs 的组成及丰度变化特征

2.1 主要ARGs 类型

8 大类ARGs 包括β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮-喹诺酮-氟苯尼考-氯霉素-安非霉素（FCA）类、多药类、万古霉素类，在污水处理厂中均能检出。其中磺胺类、四环素类、大环内酯类较为常见[13]，在美国、加拿大、中国等国的污水处理厂中被广泛检出[14]，表明这些ARGs可能存在于全球的污水处理系统中。在亚型方面，Wang 等[15]统计了全球有关污水处理厂ARGs 的文献后发现，β-内酰胺类bla、磺胺类sul、四环素类tet和大环内酯类erm的报道较为广泛，可能与其高丰度有关。城市污水管道中的污水和管道壁的生物膜上丰度最高的ARGs 是磺胺类抗性基因sul1 和sul2，占16S rRNA 基因拷贝数的约1/10[16]，其他丰度较高的亚型还包括四环素类抗性基因tetA 和tetG，万古霉素类抗性基因vanA 和vanX，β-内酰胺类的bla、amp，大环内酯类的erm以及FCA 的emr、qnr[17]（表1）。有学者对中国11 个污水处理厂中的296 个ARGs 进行检测后发现，7 种ARGs（包括氨基糖苷类抗性基因aadA、aadA1 和aadA2，β内酰胺类抗性基因blaVEM 和blaOXA-10，大环内酯类抗性基因ereA，多药类抗性基因qacEdelta1）持久存在，它们分别占进水、污泥和出水中所检测基因总拷贝数的54.1%、58.6% 和58.5%[18]。Su 等[19]采用宏基因组学分析了中国17 个城市中污水处理厂ARGs的分布，共检测出381 种ARGs 亚型，其中氨基糖苷类、四环素类和β-内酰胺类共占54.1%，亚型中sul1 和tet40 最为常见。

表1 不同地区污水处理厂中不同种类ARGs 在进水、出水、污泥中的丰度变化Table 1 Variations of abundance of different kinds of ARGs in influent, effluent and sludge in various WWTPs

2.2 典型ARGs 的沿程变化

整体上，ARGs 经过一系列污水处理单元后，其在出水中的丰度（约103～1010拷贝/L）低于进水丰度（104～1012拷贝/L），去除率可达89.0%～99.8%[20]（表1）。但由于ARGs 的丰度和转移机制受ARGs种类以及污水处理过程中多种因素的影响，不同ARGs 的丰度随污水处理过程的变化特征各异，且不同处理单元中的高丰度ARGs 存在差异。具体地，磺胺类、四环素类ARGs 在进水中丰度较高，多在1010拷贝/L 左右，且二者在生物处理单元大量扩增，最后随污泥沉降，在出水中丰度降低，去除率较高[24]；而氨基糖苷类、β-内酰胺类等ARGs 在前端处理阶段相对丰度较低，但在出水中被大量检出，数量级高达108拷贝/L[20]（表1）。部分磺胺类、β-内酰胺类、FCA 类ARGs 的去除没有明显规律，如sul1、qnrD 和blaTEM[28]在污水处理厂各个处理阶段的丰度几乎保持不变，与制药废水[29]、印染废水[27]处理工艺中被大量去除的结果不同，这可能是由于此类基因具有复杂的代谢通路，或参与共选择作用[29]（图2）。

图2 污水处理厂中ARGs 沿程变化模式Fig.2 Conceptual map of ARGs changes along the process in a WWTP

除了上述按照相应抗生素种类与结构分类外，ARGs 还可分为胞内型ARGs（iARGs）和胞外型ARGs（eARGs）。iARGs 多存在于污水处理厂等与人类活动相关的场所，而eARGs 多分布于自然环境中[30]。通常，污水处理厂进水中eARGs 的数量级（102拷贝/L）远低于iARGs（108拷贝/L），甚至无法检出，但污水厂其余构筑物以及出水eARGs 的绝对丰度和iARGs 相近（105拷贝/L）[23,31]，主要原因是污水处理过程中正常细胞的分泌外排和衰老细胞的裂解释放使得eARGs 含量逐渐升高，而eARGs 又难以随生化处理被去除，因此出水中eARGs 与iARGs 数量级相近，污水处理厂可能是ARGs 形态转化的重要场所。

3 ARGs 在城市污水处理厂中的转移机制

ARGs 的转移方式主要包括垂直转移（VGT）和水平转移（HGT）2 种（图3）。VGT 指ARGs 通过增殖从亲代到子代含量逐渐增多的转移过程[32]，当环境中无抗生素选择时该转移机制较为明显；HGT 则指ARGs 在不同菌属、环境间的转移，能实现无性、远缘的基因传递。活性污泥系统中较高的微生物浓度和多样性能够促进细菌间ARGs 的HGT[33-34]，同时，进水中次抑制浓度的抗生素为活性污泥系统中ARGs 水平传播创造了有利条件[35]。因此，HGT 是活性污泥ARGs 主要的转移方式[36]。例如，四环素类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类等ARGs 可通过质粒进行HGT[37-38]，大环内酯类和四环素类还能通过整合结合元件（ICEs）等可移动遗传元件（MGEs）进行HGT。不少研究表明intI1 与磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内酯类的部分亚型具有强相关性[24]，常作为HGT 的指示性基因。研究发现临床intI1 基因序列和intI1 相似，临床intI1 与ARGs 及人类病原体的丰度、去除效率的相关性更强[20]。后续可以深入研究临床intI1，以进一步筛选和确定污水处理厂中的指示性ARGs。

图3 ARGs 的垂直和水平转移机理Fig.3 Mechanism of vertical and horizontal transfer of ARGs

iARGs 和eARGs 具有不同的HGT 途径：iARGs可通过细胞间的接合和转导进入新宿主细胞；而eARGs 则在原宿主细胞裂解后通过转化直接被新宿主细胞吸收[8]〔图3（b）〕。研究表明，自然环境中的各HGT 途径中iARGs 接合频率＞ eARGs 转化频率＞ iARGs 转导频率[39]。细菌受激后变成感受态是转化的关键，而多数抗生素[40]、非抗生素类药物[41]均能刺激细菌，提高细胞活性、细胞膜通透性，促进细菌转化[42]。噬菌体介导的ARGs 转导过程是一种关键的HGT 途径，在一些污水[43]和污泥[44]噬菌体的基因组中也检测出β-内酰胺类、磺胺类等ARGs。有学者检测发现农村分散式污水处理设施中ARGs 的丰度与多种噬菌体相关[45]。随着检测技术和研究方法的快速发展，基因转移剂（GTAs）逐渐受到关注。GTAs 是性能类似噬菌体的小型病毒样颗粒，能够随机选择宿主DNA 片段并将其转移给受体细胞，其随机性为ARGs 的HGT 带来了较大风险[46]。

4 污水处理厂中影响ARGs 赋存及水平转移的主要因素

除微生物群落外，污水进水水质、抗生素等污染物、温度等环境因素以及停留时间等工艺条件同样会对ARGs 的赋存及传播机制产生影响（图4）。

图4 污水处理厂中ARGs 的主要影响因素Fig.4 Main influencing factors of ARGs in WWTPs

4.1 抗生素选择

抗生素的使用对ARGs 存在着一定的选择作用。例如有学者观察到进水中的ARGs 在秋季和冬季具有较高浓度，与这2 个季节的高抗生素处方量呈正相关关系[20]；磺胺嘧啶、磺胺甲唑的存在可提高sul1、sul2、dfrA1 的丰度[47]；高浓度的四环素能增加tetX 的含量[48]。但抗生素对ARGs 的选择作用并非完全严格对应，某些抗生素对ARGs 的选择作用具有交叉性[8]，如氯霉素类抗生素与氨基糖苷类ARGs 的共现[49]，加入氨苄青霉素（一种β-内酰胺类抗生素）后多种非β-内酰胺类ARGs 共现，并为大肠杆菌的抗性作出贡献[50]。但也有学者观察到进水浓度较高的环丙沙星并未造成特定耐药基因的富集[51]，可能存在选择滞后性或与其他抗生素的共选择[52]。用多种抗生素药物筛选时，可以看到不同ARGs 的富集，且杀菌抗生素对ARGs 的富集效果比抑菌抗生素更强[53]。此外，某些抗生素还会影响ARGs 的HGT。例如，痕量四环素能增加污泥中tetA 和tetG 等四环素类抗性基因含量以及HGT 潜能，而高浓度四环素反而对HGT 产生抑制作用[54]。

4.2 非抗生素选择

重金属[55]、芳香化合物[56]、非抗生素药物[57]、纳米颗粒[58]等废水中常见或新兴的污染物质也会影响ARGs 的赋存和转移特征。由于重金属不易被降解，会在环境中构成持续的选择压，可能对抗生素抗性具有更重要的选择性[59]。因此，重金属协同选择细菌抗生素抗性的课题一直备受关注。越来越多的研究证明，抗生素抗性水平随重金属污染水平的增加而增加。例如，Stepanauskas 等[55]在微宇宙试验中发现水中抗生素抗性检出频率随重金属暴露浓度的升高而升高；Komijani 等[60]研究重金属对湖泊中ARGs 分布特征的影响后指出，ARGs 的丰度与钒等重金属浓度的相关性强于抗生素，湖泊重金属污染增强了细菌对各种抗生素的耐药性。此外，重金属和抗生素的抗性基因与MGEs 的共同关联有助于基因协同传播[61]，部分重金属抗性基因（HMRGs）与intI1 基因具有相关性[62]，会影响ARGs 的HGT。

非抗生素类有机物广泛存在于农药、染料、药物的生产废水中，具有难降解、高毒性等特点。由于芳香化合物降解基因（ADGs）与多重耐药类、β-内酰胺类等ARGs 在细胞基因组中具有高共现性[63]，因此芳香族化合物可显著影响ARGs 的种类与丰度[56]。此外，ARGs 的HGT 也受有机物的影响。非抗生素药物卡马西平[52]以及氨基类芳香化合物（PAP）、硝基类芳香化合物（PNP）、苯酚(PhOH)[61]、印染染料[56]等有机物，能通过增加活性氧水平、增强细胞膜通透性、调控质粒复制等方式促进HGT。纳米颗粒（NPs）与ARGs 作用关系复杂，NPs 能促进ARGs的接合、转导，造成富集与传播[64]，但也有研究表明银纳米颗粒等NPs 能有效去除ARGs[65]。此外，同为新兴污染物的微塑料能促进ARB 增殖[66]，对ARGs 的富集和HGT 具有促进作用[67]。由于能垒较低，微塑料对于eARGs 的吸附作用强于iARGs，对eARGs 的HGT 的促进作用也更强，对eARGs 的富集倍数高达iARGs 的13.1 倍[68]。也有研究表明，微塑料对二沉池出水中ARGs 的富集能力显著高于进水与污泥中的ARGs[69]。

4.3 环境因素及水质条件

污水处理厂的运行受外界环境条件及进水水质的影响，如温度、生化需氧量（BOD5）、化学需氧量（COD）、氨氮浓度等，这些因素同样影响ARGs 的赋存及HGT。学者观察到ARGs 的丰度与温度存在显著相关性[70-71]，但温度如何影响ARGs 丰度的变化尚未有明确结论。例如，有研究测得污水处理厂中温度与bla、mcr等ARGs 丰度成反比[72]，与ermB、sul2丰度成正比[73]。此外，ARGs 的转移特征同样受到温度的影响：夏季较高的温度可能有利于某些基因的VGT，冬季的低温可能对HGT 更有利[28]。水质条件中氨氮和COD 对ARGs 影响较大。研究发现，blaPSE-1、tetC、ermB 等基因丰度与污水、污泥中氨氮浓度呈明显正相关[23]；较高的COD 或能促进耐药菌的繁殖，通过提高转化几率来改变ARGs 的丰度[74]。此外，Liu 等[75]研究发现将废水盐度增加到1% 时，ARGs 的总体丰度会大幅度降低，膜生物反应器（MBR）中4% 的盐度会使sul2、tetG 等基因丰度降低1/2。可能的原因是盐度降低了敏感菌落的丰度，使其携带的ARGs 丰度也随之降低[3]。

4.4 操作参数及处理工艺

污水处理系统的运行受人工调控，因此操作参数对ARGs 的影响也是研究的重点。研究表明，增加混合液悬浮固体（MLSS）浓度、溶解氧（DO）浓度和污泥停留时间（SRT）可提升ARGs 的去除率[17]，因此，具有较高MLSS 浓度、较长SRT 以及较低污泥负荷（F/M）的MBR工艺对ARGs 的去除效果优于氧化沟工艺[26,66-67]及其他传统生物处理工艺[76]。DO 浓度是ARGs 的关键影响因素，但其影响机制仍需进一步探究。研究表明相比厌氧工艺，好氧工艺对ARGs 的去除率高。但氧气也可能加剧ARB 的繁殖，厌氧缺氧状态或能抑制ARGs 的传播，如厌氧MBR 工艺展现出优越的ARGs 去除性能[77]。厌氧与好氧综合运用方能提升ARGs 的去除率。

除了常规的生化处理外，为提升出水水质污水处理厂还设置了膜分离、消毒、高级氧化技术（AOPs）等三级处理工艺，这些工艺同样能够影响ARGs 的赋存和传播。如膜滤等物理手段能够大量去除ARB 且抑制ARG 的释放[78]，膜滤与混凝沉淀结合能够进一步提升处理出水ARGs 去除效果[79]，电化学消毒、微生物燃料电池(MFCs)等技术能显著降低废水中的ARGs 丰度[53]。氯消毒虽然能氧化除去部分ARGs，但同时也会造成细胞裂解死亡释放ARGs，还可能促进ARGs 宿主的繁殖[80]，对ARGs的去除率影响不一[81]。有研究发现氯消毒后tetG、sul1、intI1 基因失活、丰度下降[82]，也有研究表明tetW、tetO、sul1 等基因消毒后丰度不变[25]，而Shi等[83]则发现氯消毒后ampC、ermB 等亚型富集。紫外线(UV)消毒常和氯消毒配合使用，二者联用的效果比单独氯消毒效果要好[84]。

AOPs 对ARGs 的去除有一定效果。其中Fenton 技术能使ARGs 绝对丰度下降2～3 个数量级，远优于生物处理工艺[85]；UV-AOPs能够通过自由基去除细胞胞外聚合物，相比UV 能极大程度降解ARGs[86]。对比UV、臭氧、Fenton 和Fenton/UV 4 种AOPs 后发现，Fenton 和Fenton/UV的效果最佳，能去除tetQ 和ermB 以及大部分ARGs[87]。ARBs 的去除与ARGs 的去除常存在矛盾[88]，需选择合适的AOPs 手段与使用条件，并进一步改进现有技术[89]。污水处理厂中ARGs 分布和转移的主要影响因素见表2。

表2 污水处理厂中ARGs 分布和转移的主要影响因素Table 2 Main influencing factors of ARGs distribution and transfer in WWTPs

5 结论与建议

抗生素抗性问题被世界卫生组织列为全球健康最大威胁之一，新型冠状病毒感染疫情以来，对于废水中病原体及ARGs 等生物类污染物质的监测与深度处理得到越来越高的重视。耐药微生物及ARGs 的广泛存在与转移传播对自然环境及人体健康安全造成了重大威胁。笔者综述了国内外城市污水处理厂中的常见ARGs 的赋存与转移特征，得出主要结论：1）磺胺类、四环素类、大环内酯类抗生素广泛存在于全球城市污水处理厂中；2）城市污水处理厂对各类ARGs 的去除率不一，其中四环素类、大环内酯类等ARGs 去除率较高；氨基糖苷类、多药类的去除率较低；3）HGT 是活性污泥ARGs 主要的转移方式，胞内和胞外2 种ARGs 具有不同的HGT 途径；4）抗生素等污染物、环境因素与水质条件、操作参数与工艺因素通过改变微生物活性等方式对ARGs 的丰度和传播产生影响。

立足于研究现状，对后续研究提出以下建议：1）进一步识别具有指示作用的ARGs，从而降低监测ARGs 的成本，以普及ARGs 的监测与控制；2）构建涵盖污水水质、环境因素、操作参数等影响因素与ARGs（包括iARGs 和eARGs）丰度、种类及水平转移机制综合模型，定量分析各因素对ARGs 的影响；3）加强对处理后丰度仍较高的ARGs 的环境风险评价研究，制定与ARGs 有关的排放标准与质量保证标准。