GRHL2与MLH1的表达与非小细胞肺癌临床特征的相关性研究

张 杰

天津市滨海新区大港中医医院呼吸内科 (天津 300270)

肺癌是源于支气管粘膜上皮、支气管腺体、肺泡的恶性肿瘤。数据显示，全球新发癌症发病率(11.6%)及死亡率(18.4%)最高的癌症为肺癌[1-2]。非小细胞肺癌(non-smaall cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的一种，占所有肺癌的80%以上；主要包括腺癌、鳞癌(鳞状细胞癌)、大细胞癌[3]。研究显示，NSCLC的癌细胞生长较慢，发生扩散转移时间与小细胞肺癌相比较晚[4]。在肿瘤的发生发展过程中，基因起到了至关重要的作用。粒状头样2(grainyhead like 2，GRHL2)基因是GRHL家族成员之一，在21世纪初被发现，后被认为是新的转录因子，参与了细胞分化、胚胎发育、表皮损伤修复等过程。大量研究显示，GRHL2的异常表达与疾病的发生发展密切相关，在乳腺癌、肝癌、鳞状细胞癌患者的组织中有GRHL2的异常表达[5]。Mutl homolog 1(MLH1)基因，是一种错配修复蛋白，可通过矫正错配变异的DNA 恢复基因的正常功能而发挥抑癌基因的作用，研究发现MLH1 基因的变异或异常甲基化与癌症的发生发展密切相关[6]。本研究分析了GRHL2与MLH1的表达与NSCLC临床特征的相关性研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2016年1月至2021年4月，在天津市滨海新区大港中医医院接受治疗并经过手术确诊的486例NSCLC患者，其中腺癌105例、鳞癌310、大细胞癌71例，男309例，女177例；患者年龄为27～83岁，平均年龄为(57.39±7.41)岁。临床分期为Ⅰ期101例，Ⅱ～Ⅲ例385期，所有患者均行手术治疗前未接受任何药物治疗或辅助治疗，手术中癌组织切除后，立即采集标本进行保存备注。排除病历资料不全者、失访者，合并严重疾病患者，手术治疗前接受化疗、免疫治疗、靶向治疗等患者。

1.2 方法GRHL2基因表达检测：将术后保存的样本，通过实时荧光定量PCR和Western blot检测GRHL2的表达。采用Trizol法提取NSCLC样本中RNA，使用逆转录试剂盒，逆转录为cDNA；通过qRT-PCR法检测GRHL2的表达情况。在所有标本中，采用Western 印迹法检测NSCLC和癌旁组织中GRHL2蛋白表达情况，Western blot法参照全应军等[9]在结直肠癌中检测GRHL2表达。

MLH1甲基化检测：采用甲基化特异性PCR( MSP)法，从保存的样本组织中提取 DNA，采用 Intergen 公司的 CPGenome TMDNA Modification Kit 对 DNA进行亚硫酸氢盐修饰，已修饰的DNA作为模板，利用甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增MLH1甲基化和非甲基化的PCR扩增条件为(95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃30s)，循环42次，最后延伸 72℃5min。之后利用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.3 观察指标整理患者临床资料，统计整理患者GRHL2的表达情况、MLH1甲基化情况，按照临床特征分类，分析GRHL2的表达、MLH1甲基化与临床特征的相关性。

1.4 统计分析应用 SPSS22.0统计软件进行数据统计分析。计数资料用[n(%)]表示，组间比较用χ2检验；GRHL2、MLH1的表达情况与临床特征的相关性分析，采用Spearman相关分析；生存分析采用生存分析。

2 结 果

2.1 患者临床特征486例NSCLC患者，在年龄＞40、肿瘤大小＞3cm、临床分期为Ⅱ～Ⅲ期、淋巴结发生转移、组织类型为鳞癌的患者较多，且差异较为明显(P＜0.05)。

表1 患者临床特征

GRHL2在癌组织中379例呈现高表达，107例低表达，而在癌旁组织中187例呈现高表达，299例呈现低表达，GRHL2在癌组织中呈现高表达趋势，在癌旁组织中，呈低表达趋势；GRHL2在癌组织与癌旁组织的表达具有明显差异(P＜0.05)。

表2 GRHL2的表达情况

在NSCLC中MLH1基因甲基化占比为46.84%，其中部分甲基化为34.29%；完全甲基化为12.55%。在癌旁组织中甲基化占比为24.61%，其中部分甲基化为5.52%；完全甲基化为19.09%。NSCLC中MLH1基因甲基化程度明显高于癌旁组织(P＜0.05)。

表3 NSCLC患者MLH1甲基化情况?

Spearman分析显示，GRHL2的表达与肿瘤大小，临床分期，淋巴结转移均存在显著相关性(P＜0.01)，与组织类型明显相关(P＜0.05)，但与年龄，性别无明显相关性(P＞0.05)。

表4 NSCLC患者GRL2与临床特征相关性分析

表4 NSCLC患者GRL2与临床特征相关性分析

临床参数 分类 n GRHL2 χ2 P r低表达 高表达(n=107) (n=379)年龄(岁) ≤40 91 25 66 1.941 0.164 0.063＞40 395 82 313性别 男 309 64 245 0.841 0.359 0.042女 177 43 134肿瘤大小(cm) ≤3 114 48 66 35.007 0.000 0.268＞3 372 59 313临床分期 Ⅰ期 101 42 59 28.433 0.000 0.242Ⅱ～Ⅲ期 385 65 320淋巴结转移 否 193 67 126 30.067 0.000 0.249是 293 40 253组织类型 鳞癌 310 79 231 5.994 0.014 0.111腺癌或其他 176 28 148

2.5 GRHL2表达和MLH1甲基化与患者预后相关性MLH1甲基化、GRHL2高表达与NSCLC患者生存时间呈负相关(P＜0.01)。

表5 GRHL2表达和MLH1甲基化与患者预后相关性

3 讨 论

hMLH1基因位于3号染色体p21区。是人体重要的DNA错配修复蛋白基因，该基因的突变或甲基化异常，可引起细胞错配修复功能缺陷，导致肿瘤的发生。DNA错配修复基因一类肿瘤相关基因，其非癌基因，也非抑癌基因，但在肿瘤发病的分子机制方面起到重要作用。主要包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1和hPMSH2等基因。hMLH1基因的异常甲基化可引起微卫星DNA，影响错配修复蛋白相互配合完成 DNA损伤的修复过程[7]。本研究结果显示，NSCLC中MLH1基因甲基化占比为46.84%，癌旁组织中甲基化占比为24.61%，NSCLC中MLH1基因甲基化程度明显高于癌旁组织。表明MLH1基因甲基化异常，与癌细胞恶性转化和肿瘤进展相关，另外，经过Spearman相关性分析发现MLH1甲基化与患者生存时间呈现明显负相关。这一结论，与王延宁等人在NSCLC的相关研究中结果相似。

经整理分析发现486例NSCLC患者中，年龄＞40岁，男性患者较多，这与国家癌症中心最新发布的2019年癌症数据报告内容一致，其中男性肿瘤发病率位居的首位为肺癌，其高发年龄段为55岁以上。另外，本研究中肿瘤大小＞3cm、临床分期为Ⅱ～Ⅲ期、淋巴结发生转移、组织类型为鳞癌的患者较多，这与目前医疗技术水平和人们健康意识相关。往往肺癌在发现确诊时均处于中晚期，不利于患者治疗及预后，这也是我国肺癌生存率较低的主要原因[8]。

GRHL2基因可以促进细胞增殖，诱导细胞凋亡，其异常表达也与多种肿瘤的发生发展密切相关[9]。本研究发现，GRHL2在NSCLC组织中呈现高表达趋势，在癌旁组织中，呈低表达趋势；并具有明显差异(P＜0.01)。经过相关性分析发现，GRHL2的表达与肿瘤大小，临床分期，淋巴结转移均存在显著相关(P＜0.01)，与组织类型明显相关(P＜0.05)。表明GRHL2基因可能参与NSCLC的发展过程，同时，GRHL2基因在鳞癌中存在高表达状态，可能与其生理功能相关。我们还发现，MLH1甲基化、GRHL2高表达与NSCLC患者生存时间呈负相关，同时大量临床数据显示GRHL2基因的高表达与乳腺癌患者的无复发的生存时间负性相关，并且可以增加患者的转移风险[10]，这一结论与本研究结论一致。

综上所述，MLH1甲基化、GRHL2差异表达与NSCLC患者肿瘤大小，临床分期，淋巴结转移情况密切相关，同时与患者生存时间呈负相关，在NSCLC的治疗过程中具有重要的参考价值。