芽孢杆菌复合菌剂降解玉米秸秆的性能研究

张 超 李晓意 杨 吉 孙金旭 高群英 王 茜 高小宽

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 053000）

河北省作为华北平原上的农业大省，主要种植小麦、玉米、高粱和谷子等农作物。因此，农作物秸秆分布广、产量大，仅衡水市每年可收集秸秆量就为485 万t，其中玉米秸秆276 万t，约占秸秆总量的56.9%[1]。玉米等农作物秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素等植物细胞壁组成，该类组分都属于有机碳水化合物大分子，是优质的可再生资源[2]。但因其结构致密、复杂，难以降解，导致利用率下降。因此，如何实现玉米秸秆的高效降解已成为当前研究的重点。

复合菌剂凭借自身丰富的秸秆降解酶系和菌株间相互协同促进的降解作用，成为农作物秸秆的重要研究方向。梅新兰等[3]通过构建细菌- 真菌复合菌剂，使水稻秸秆的降解率以及纤维素酶活显著提高。江高飞等[4]研究真菌复合菌系降解玉米秸秆发现，降解菌多样性的增加有助于增强秸秆的降解效果。本研究利用实验室保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和地衣芽孢杆菌(Bacil-lus lincheniformis)构建复合菌剂，研究其对玉米秸秆的降解性能，为高效降解秸秆提供菌株资源和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料。玉米秸秆采集于衡水市深州农田，洗净、晾干，粉碎后过30 目筛。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)保存于本实验室。

1.2 培养基配方。LB 培养基[5]。玉米秸秆降解培养基：蛋白胨5.0 g/L、(NH4)2SO42 g/L、MgSO40.5 g/L、K2HPO41 g/L、NaCl 0.5 g/L、玉米秸秆粉50 g/L、pH值7.0、121 ℃高温灭菌20 min。

1.3 试验方法

1.3.1 芽孢杆菌种子液的制备。用无菌枪头挑取3 种芽孢杆菌的单菌落，分别接入含100 ml LB 培养基的三角烧瓶中，转移至恒温培养箱，37 ℃、180 r/min震荡培养24 h。

1.3.2 单菌株和复合菌剂降解玉米秸秆方法。收集种子液，10 000 r/min 离心，弃上清，菌体沉淀用无菌生理盐水分别制备含枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌悬液，使菌体浓度达到1 ×109CFU/ml。按5%接种量将3 种芽孢杆菌的菌悬液分别接入100 ml 玉米秸秆降解培养基中，形成单菌株玉米秸秆降解体系；将3 种芽孢杆菌的菌悬液按1∶1∶1的比例，5%的接种量接入玉米秸秆降解培养基，形成复合菌剂玉米秸秆降解体系。2 种体系均在25 ℃、100 r/min 的条件下发酵培养15 d。试验设3 个重复。

1.3.3 纤维素酶活的测定。酶活测定包括羧甲基纤维素酶活(CMCase)和滤纸(FPA)酶活测定，具体方法如下：取发酵完成后的培养液，10 000 r/min 离心后取上清即为粗酶液，采用DNS 法[6]，以1 ml 1%CMC-Na 和100 mg 滤纸为底物，分别与1 ml 粗酶液完成反应。酶活力单位(U)定义为：在上述条件下每分钟催化底物生成1 μmol 还原糖所需酶量为1 个活力单位。

1.3.4 玉米秸秆降解率的测定。采用失重法评估玉米秸秆的降解效果，具体方法如下：将发酵完成后的玉米秸秆粉用滤纸过滤，蒸馏水反复清洗，105 ℃烘干8 h，称重，按以下公式计算降解率。

公式中w0为对照玉米秸秆粉干重，mg；w为降解后玉米秸秆粉干重，mg。

1.3.5 统计分析。数据处理采用Graph Prism 7.0 软件进行分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 3 株芽孢杆菌和复合菌剂的纤维素酶活评价。由图1 可知，3 株芽孢杆菌单菌株CMCase 活性相差较大，其中地衣芽孢杆菌的活性最高，达到39.290 ±2.499 U/ml，枯草芽孢杆菌次之，酶活为 37.458 ±1.335 U/ml，贝莱斯芽孢杆菌的酶活最低，仅 为 28.066 ±4.703 U/ml。而复合菌剂的CMCase活性较单菌株有显著提升，达到113.522 ±5.528 U/ml；3 株芽孢杆菌的FPA 活性从大到小依次为贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，酶活分别为13.961 ±1.493 U/ml、11.153 ±1.746 U/ml和9.375 ± 0.441 U/ml，而复合菌剂的FPA 则高达29.851±3.061 U/ml。上述结果表明，与单菌株相比，复合菌剂纤维素酶活大幅提升，表现出明显的菌株间协同促进作用。

图1 单菌株与复合菌剂的纤维素酶活

2.2 株芽孢杆菌和复合菌剂的秸秆降解效果评价。以玉米秸秆粉为试验材料，经单菌株和复合菌剂15 d发酵降解后，过滤、洗涤、烘干和称重，计算降解率，结果如图2 所示，单菌株的降解率均低于40%，其中贝莱斯芽孢杆菌的降解率最高，达到36.53%，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的降解率分别为20.04%和28.49%，而复合菌剂的玉米秸秆降解率为72.47%，显著高于上述单菌株降解率。

图2 单菌株和复合菌剂的秸秆降解率

3 结论与讨论

芽孢杆菌属细菌种类丰富，且大多能分泌纤维素酶，用于玉米秸秆的降解可取得较好的降解效果，如林源等[7]利用1 株枯草芽孢杆菌产生的纤维素酶，降解玉米秸秆发酵生产乙偶姻用于造纸。倪志华等[8]使用1 株凝结芽孢杆菌发酵酸解玉米秸秆用于乳酸生产。本研究选择前期筛选的秸秆降解菌株，即枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌构建复合菌剂，经15 d 发酵降解玉米秸秆，测得纤维素酶活，如CMCase 为113.522 ±5.528 U/ml 和FPA 为29.851 ±3.061 U/ml，秸秆降解率高达72.47%，显著优于单菌株降解效果，这为秸秆降解复合菌剂的开发提供了参考。