一例长颈鹿支原体感染的诊断

何松，汤德元，毛茵茗，周飘，廖正波，袁盛林，陈旭

（贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025）

支原体又称霉形体，天然无细胞壁，细胞柔软，高度多形性，其大小介于细菌和病毒之间，具有三层膜结构，可通过200～450 纳米孔径的滤膜，以二分裂方式生长繁殖，在液体或固体培养基中生长较慢，一般在5%CO2细菌培养箱中培养3～7 天，染色其形状呈典型的“油煎蛋”样，革兰氏染色阴性但着色效果不佳，姬姆萨染色良好。支原体于1961 年在美国首次于病牛患有乳腺炎的病料中分离出，我国在1983 年首次在患有牛乳腺炎的牛奶中分离到牛支原体。目前，支原体广泛分布于自然界，许多动物都有感染，已经发现了近200 种。支原体在避免阳光直射条件下可存活数周，在4℃牛乳和海绵中可存活2 个月之久，在水中可存活2 周以上，但支原体一般不耐高温，在65℃经2 分钟、70℃经1 分钟即可失活，但在4℃～37℃液体介质中的存活力不受影响，可以存活半年之久。支原体能够引起动物呼吸系统疾病、关节炎、乳腺炎或角膜结膜炎等症状，给世界相关养殖户带来了严重的经济损失。

长颈鹿是一种生长在非洲稀树草原地带以树叶及小树枝为主食的反刍偶蹄动物，隶属于哺乳纲长颈鹿科，是世界上现存最高的陆生动物,牙齿为原始的低冠齿, 舌长且灵活, 具短角, 角上被有毛的皮肤覆盖。成年长颈鹿高4～6 米，体重600～900 千克，是当前最具观赏性的陆生动物。罗琴等人调查了广州市某野生动物园草食类及灵长类野生动物肠道寄生虫的感染情况，他们采用粪便检查法共检查36 种动物500 份粪样，总阳性率达到了50.6%，其中长颈鹿、角马、弯角剑羚样品多为混合感染，表明长颈鹿等野生动物被一些寄生虫及微生物混合感染较为普遍。在本病例中，我们发现贵州森林野生动物园一只长颈鹿发病死亡，其临床症状表现为精神沉郁、消瘦、食欲下降和呼吸困难，病程大约一个星期，根据其临床症状疑似支原体感染，随后我们采集其心脏、肺脏和肝脏等病变组织进行实验室诊断，以期从样品病料中找到长颈鹿死亡原因，为今后更好保护长颈鹿预防支原体感染提供参考。

1 临床症状

长颈鹿的发病临床症状为消瘦、食欲下降、呼吸急促、频率60 次/分钟，体温升高达40.3℃，病程大约一个星期，对死亡长颈鹿进行剖检发现：肺有坏死点，心脏有大量的心包积液。采集病变样品：心包积液、肝脏和肺脏进行实验室诊断。

2 实验室诊断

2.1 细菌镜检

对送检长颈鹿心组织、肝组织、肺组织进行革兰氏染色：初染，滴加结晶紫，染色1～2 分钟，水洗；媒染，用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗；脱色，用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管滴加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20～30秒），立即水洗；复染，用藩红复染约2 分钟，水洗；镜检，用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。镜下检查结果显示：有少许革兰氏阴性菌。

2.2 细菌分离培养

无菌操作从死亡的长颈鹿的肺组织﹑心脏组织和肝组织取样分别划线接种于需氧及厌氧的血清LB 培养基培和麦康凯培养基上，37℃恒温箱培养24～48 小时，LB 培养基和麦康凯培养基上未见细菌生长。

2.3 支原体PCR 检测

病死长颈鹿的肺部等剖检病变不能作为诊断的依据, 必须采用实验室诊断以进行确诊，取肺组织﹑心脏组织和肝组织各一小块置于研钵中碾碎，再用匀浆机打碎组织，打碎组织后反复冻融3 次，取上清100 微升，加入200 微升蛋白酶K，再加入200 微升溶液AL，涡旋振荡15 秒，56℃孵育10 分钟。实验室保存的阳性病料处理：取阳性对照100 微升，加入20 微升蛋白酶K，再加入200 微升溶液AL，涡旋振荡15 秒，56℃孵育10 分钟，之后按照支原体DNA 的提取试剂盒要求提取DNA。PCR 扩增每份总体积25 微升，2微升Taq DNA 聚合酶，2 微升模板DNA，2 微升引物，最后加ddH2O 到25 微升。在PCR 扩增仪上进行扩增程序：94℃预变性3 分钟、94℃变性30 秒、50℃退火30 秒、72℃延伸45 秒，共35 次，最后72℃延伸10 分钟。反应结束后取7 微升PCR 产物进行琼脂糖凝胶中电泳检测，用凝胶成像系统拍照记录。其结果中检测出支原体特异性阳性条带，结合前面的临床症状和诊断，表明长颈鹿死于支原体感染。

3 讨论

本研究通过对死亡长颈鹿的相关脏器进行细菌培养及PCR 鉴定，从肺脏和心脏中检测出支原体特异性阳性条带，结合临床症状及实验室诊断综合分析，诊断为支原体感染引起的肺炎和心肌炎造成长颈鹿死亡。支原体感染往往并不导致直接致命的损伤，而是通过长期持续的感染，诱发机体发生免疫损伤和凋亡而导致病变及续发感染，进而导致患病动物的死亡。肺炎支原体致病菌株在肺组织中具有很强的生长繁殖能力，能引起肺部炎症，并诱发严重的续发感染，从而导致感染动物死亡。本病例中长颈鹿感染支原体而死亡，为长颈鹿支原体病防控敲响了警钟。

图 支原体PCR 扩增结果

国内动物园关于长颈鹿支原体感染的病例报道很少，如果日常饲养管理中观察不够细致，极有可能延误最佳治疗期，导致病情加重而死亡。由于支原体没有细胞壁，因此对青霉素和头孢类药物不敏感，用来治疗支原体的感染其效果不佳；而支原体对环丙沙星、四环素、泰乐菌素、泰妙菌素等抗菌药物较为敏感，可以对支原体的感染起到一定的治疗作用，但不同药物其临床效果存在一定的差异，这可能与感染动物的抵抗力、支原体的耐药性及继发感染等因素有一定的关系。支原体病的发生与环境、天气、喂食、饮水、管理等因素有关，因此本病的防制不能完全依赖抗生素和疫苗，而应采取综合性防制措施，同时加强环境的消毒和改善饲养管理条件。近期有人评估了不同浓度的柠檬酸和次氯酸钠对支原体的消毒效果，结果发现，在有机物质存在条件下，0.5%柠檬酸和1%次氯酸钠能使支原体的活力显著降低，达到了预期的消毒效果，为长颈鹿圈舍消毒提供了参考。在本案例中其他长颈鹿也出现了征兆明显的临床症状，随后采集其血液进行支原体抗体检测，检测出支原体抗体，同时通过使用阿奇霉素类药物进行治疗并清洁环境卫生，效果明显，这为长颈鹿感染支原体的防制提供了参考。