肉制品中大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光PCR检测方法的研究

杨 滴

（大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁大连 116600）

大肠埃希氏菌O157:H7（E.coliO157:H7）是肠出血型大肠埃希氏菌的一种主要血清型，是一种危害严重的食源性病原微生物，其广泛分布于自然界，严重威胁公众健康[1-3]。近年来，由致病性微生物引起的食品污染事件呈上升趋势。肉及肉制品营养丰富，可满足人们的需求，但极易滋生各类有害细菌[4]。相关调查发现，肉及肉制品受致病菌的污染最为严重，而E.coliO157:H7 污染占比很大[5]。

现阶段E.coliO157:H7 的主要检验方法为微生物分离培养鉴定，其过程烦琐、费时费力、易产生假阳性[6]。基于TaqMan 探针的实时荧光PCR 技术是微生物检验的主要辅助手段，具有高效、特异、精准的优点。本研究旨在以E.coliO157:H7 菌体抗原基因rfbE为对象，研发一种肉制品中E.coliO157:H7实时PCR 检测方法，为肉制品中E.coliO157:H7 的检测提供技术支持，为市场监管提供保障。

1 材料与方法

1.1 菌株

本研究使用11 株标准菌株，均购于CICC。所有标准菌株信息见表1。

表1 标准菌株信息

1.2 主要试剂

营养肉汤培养基；细菌基因组DNA 提取试剂盒；Premix Ex Taq PCR 试剂盒。

1.3 主要仪器

ABI QS7 Flex 荧光定量PCR 仪；超低温离心机；DNA 分析仪。

1.4 实验方法

1.4.1 引物与探针

根据E.coliO157:H7 菌体抗原基因rfbE序列，使用Primer express 3.0 软件设计特异性引物和TaqMan MGB 探针，引物探针由上海生工公司合成，引物及探针序列见表2。

表2 实时荧光PCR 引物及探针序列

1.4.2 DNA 模板制备

将E.coliO157:H7 和其他10 株标准菌株接种于营养肉汤培养基，36 ℃培养24 h。取100 μL 增菌液，提取DNA 作为实时荧光PCR 模板。

1.4.3 实时PCR 的反应体系及条件

实时荧光PCR 扩增采用20 μL 反应体系，具体各种试剂浓度、体积见表3。

表3 实时荧光PCR 扩增反应体系

实时荧光PCR 反应程序参考试剂盒说明书为95 ℃预变性30 s，然后进入循环反应，即95 ℃变性5 s、60 ℃退火和延伸30 s，共40 个循环。

1.4.4 特异性研究

将E.coliO157:H7 等11 株标准菌株按照1.4.2制备DNA 模板，并用无菌水作为无模板对照，实时荧光PCR 反应体系和条件按优化结果设置，验证实时荧光PCR 检测E.coliO157:H7 的特异性。

1.4.5 灵敏性研究

将E.coliO157:H7 标准菌株增菌液进行倍比梯度稀释，形成梯度含菌量为1×106CFU·mL-1至1×101CFU·mL-1的6 个浓度的菌悬液。每个稀释度取1 mL 菌悬液，按照1.4.2 制备DNA，探讨实时荧光PCR 检测E.coliO157:H7 的灵敏性。

1.4.6 实际样品检测

选取市售鲜猪肉、鲜牛肉、鲜羊肉、鸡胸肉、烤鸭、熟猪头肉、酱牛肉、牛肉干、酱猪耳和酱牛蹄筋共10 个样品，分别取上述样品25 g 放入装有225 mL营养肉汤的培养基中，于36 ℃培养箱培养24 h。取增菌液1 mL 提取DNA 后，进行实时PCR 反应，探讨本研究的实用性。

2 结果与分析

2.1 特异性结果

本试验以CICC 10907E.coliO157:H7 为目标菌株，以金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等10 株标准菌株为非目标菌株，高纯水为无模板对照，验证实时荧光PCR 法检测大肠埃希氏菌O157:H7 的特异性。扩增结果见图1，只有目标菌株具有扩增曲线，其他10 株非目标菌株无扩增曲线。结果表明，本研究建立的实时荧光PCR 检测法具有较强的特异性。

图1 实时荧光PCR 检测大肠埃希氏菌O157:H7 特异性试验

2.2 灵敏性结果

分别吸取1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1和1×101CFU·mL-1的E.coliO157:H7 菌悬液1 mL 进行DNA 提取，提取的DNA 进行实时荧光PCR 试验。E.coliO157:H7 灵敏性试验结果见图2。结果显示，大肠埃希氏菌O157:H7 浓度为1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1时均有扩增曲线浓度低于1×102CFU·mL-1时无扩增曲线，该方法检测的低限为1×102CFU·mL-1。

图2 实时荧光PCR 检测大肠埃希氏菌O157:H7 灵敏性试验

2.3 实际样品检测结果

对鲜猪肉、鲜牛肉、鲜羊肉、鸡胸肉、烤鸭、熟猪头肉、酱牛肉、牛肉干、酱猪耳、酱牛蹄筋共10 个样品的营养肉汤增菌液进行DNA 提取，以大肠埃希氏菌O157:H7 为阳性对照，进行实时荧光PCR试验，扩增结果见图3。结果显示，鲜猪肉、鲜牛肉、鲜羊肉中检测出含有E.coliO157:H7。

图3 实时荧光PCR 检测实际样品试验

3 结论与讨论

研发一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术已经成为当今社会中肉与肉制品安全监测发展的必然趋势[7]。长期以来，肉制品中大肠埃希氏菌O157:H7 检测主要依据细菌培养、生化鉴定，该方法步骤烦琐，且耗时长。实时荧光PCR 技术具有灵敏度高、重复性好、反应高效、准确性高、检测周期短等优点[8]，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域[9]。本研究以rfbE基因为目标基因，通过反复摸索，建立了一种特异性强、灵敏性高、切实可行的检测肉制品中大肠埃希氏菌O157:H7 的实时荧光PCR 方法。本研究设计含有不同浓度的大肠埃希氏菌O157:H7（1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1和1×102CFU·mL-1）菌液样品，试验得到该检测方法的低限为1×102CFU·mL-1。本检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为肉制品中大肠埃希氏菌O157:H7 的快速检测奠定了基础。