右美托咪定预处理对视网膜缺血再灌注损伤的保护效应及机制研究

周岩岩

武陟济民医院麻醉科，河南 焦作 454950

视网膜缺血再灌注损伤为临床常见眼科疾病，眼外伤、高眼压及视网膜中央动脉阻塞等因素为其发病原因。该病易造成视神经出现不同程度损伤，对视功能有所危害，故保护视神经为眼科研究重点［1］。右美托咪定为美托咪定右旋异构体的咪唑类衍生物，是一种选择性高的α2肾上腺素能受体激动剂。研究显示［2］，右美托咪定心肌缺血再灌注损伤中具有抗氧化应激、抗炎及抗细胞凋亡等作用，且围术期使用右美托咪定能降低患者心血管不良事件发生与死亡率［3］。为此，本研究探讨了右美托咪定预处理对视网膜缺血再灌注损伤的保护效应与机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取30只雄性大鼠，来源于上海凯学生物科技有限公司，8周龄，体重为50～250 g。

1.2 方法

将30只雄性大鼠分为健康组、缺血组和预处理组，每组10只。健康组大鼠各项指标均正常，缺血组采用高眼压法制造的大鼠视网膜缺血再灌注模型，预处理组对缺血组小鼠进行了右美托咪定预处理。分别于缺血前15 min作用及再灌注前5 min左右，健康组及缺血组按照5 mL/kg大鼠体重进行生理盐水灌注，预处理组对缺血组小鼠按照25 μg/kg大鼠体重进行了盐酸右美托咪定（扬子江药业集团有限公司，国药准字H20183219）预处理灌注。

视网膜缺血再灌注损伤模型建立方法：先对本实验30只大鼠进行11%水合氯醛全身麻醉，再局部滴用0.4%倍诺喜言表进行眼部麻醉3次。麻醉后，采用固定器将大鼠按照仰卧位放置，采用0.5%作用的氯霉素眼药水对大鼠眼部结膜囊进行严格清洗，最后用安尔碘对大鼠眼眶及其周围视野进行严格消毒，防止其余物质影响实验结果的准确性。将输液器开始一端和血压计相连的水银柱输气管用三通管连接。通过进行不同程度的手部按压将水银柱升高至14 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。采用穿刺针头插入大鼠右眼结膜，直至找到前房位置，通过观察水银柱记录大鼠的眼内压。视网膜缺血再灌注时，为防止角膜因长时间暴露过于干燥，需要进行间断性的在角膜间滴加生理盐水，通过人为按压，将眼内压升高至110 mmHg，为造成视网膜缺血再灌注损伤需要一直维持约1 h。随后即可慢慢的关掉充气柄开关，当眼内压降低到14 mmHg后，为防止损伤眼膜及其周围晶状体组织，需要慢慢的拔除针头，并于大鼠眼结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。

1.3 观察指标

比较三组大鼠于再灌注24 h时的视网膜电图（ERG）、细胞凋亡指数（AI）、促凋亡因子（Bax）、抑凋亡因子（Bcl-2）表达水平、肿瘤坏死因子（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）表达水平。

（1）比较三组大鼠于再灌注24 h 时ERG：大鼠在经过暗适应半小时后对被检眼给予1%地卡因表面麻醉，0.5 g/L托吡卡胺进行充分散瞳。大鼠被检眼用固定架固定后保持不动，在角膜上置封闭式角膜接触镜电极，另一电极置于额部，眼附近的面部安放参考电极，接地电极置于耳前。先作暗适应闪光视网膜电图或图像视网膜电图，然后明适应1 min，再作光适应闪光视网膜电图或图像视网膜电图。观测a 与b 波的潜时和波幅，观测震荡波［4］。（2）比较三组大鼠于再灌注24 h时的AI：石蜡切片二甲苯和梯度乙醇脱蜡、水化后，使用PBS进行冲洗，于37 ℃下用蛋白酶K工作液进行处理；用细胞凋亡检测试剂盒（德国Roche 公司，TUNEL）处理，于荧光显微镜（Olympus，ix53型）下观察视网膜细胞凋亡。随机选择各切片5个视野，统计凋亡细胞与总细胞，凋亡细胞核棕褐色，AI=凋亡细胞计数/总细胞计数×100%［5］。（3）比较三组大鼠治疗后Bax 及Bcl-2 表达水平：向视网膜组织加入蛋白裂解液以提取其蛋白，实用BCA试剂盒测定其浓度，蛋白样品置于离心管内，加上样缓冲液煮沸使其变性，保存备用；制备10%SDS-PAGE分离胶与5%浓缩胶，分别取蛋白样品上样，电泳后移入PVDF 膜中，封闭后加入Bax 一抗、Bcl-2 一抗孵育过夜。采用凝胶成像分析系统扫描测定灰度值，蛋白相对表达水平为目的蛋白条灰度值/内参β-actin 条灰度值。（4）比较三组大鼠治疗后TNF-α及IL-6 表达水平：取患者治疗前治疗后静脉血各5 mL，以3 000 r/min离心处理10 min，取上层血清，使用采用双抗体夹心酶联免疫法测定血清TNF-α、IL-6水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，方差齐使用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠左右眼ERG b波振幅情况

健康组ERG 显著优于缺血组，缺血组ERG 显著优于预处理组，三组大鼠组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组大鼠左右眼ERG b波振幅情况（±s）μV

表1 三组大鼠左右眼ERG b波振幅情况（±s）μV

组别健康组（n=10）缺血组（n=10）预处理组（n=10）F值P值左眼154.81±8.86 23.92±2.78 57.25±4.56 1 296.980＜0.001右眼160.62±7.24 32.14±7.29 73.78±9.35 667.990＜0.001

2.2 三组大鼠细胞凋亡指数情况

健康组AI 显著优于缺血组，缺血组AI 显著优于预处理组，三组大鼠组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组大鼠细胞凋亡指数情况（±s）%

表2 三组大鼠细胞凋亡指数情况（±s）%

组别健康组（n=10）缺血组（n=10）预处理组（n=10）F值P值AI 1.55±0.16 14.36±4.58 7.52±2.73 43.320＜0.001

2.3 三组大鼠凋亡因子情况

健康组Bax 显著高于缺血组，缺血组Bax 显著高于预处理组；健康组Bcl-2显著低于缺血组，缺血组Bcl-2显著低于预处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 三组大鼠凋亡因子情况（±s）

表3 三组大鼠凋亡因子情况（±s）

组别健康组（n=10）缺血组（n=10）预处理组（n=10）F值P值Bax 1.33±0.26 2.54±0.43 1.13±0.31 50.090＜0.001 Bcl-2 1.87±0.26 0.94±0.13 1.62±0.21 54.040＜0.001

2.4 三组大鼠炎症因子水平情况

健康组TNF-α、IL-6 显著高于缺血组，缺血组TNF-α、IL-6 显著高于预处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 三组大鼠炎症因子水平（±s）ng/mL

表4 三组大鼠炎症因子水平（±s）ng/mL

组别健康组（n=10）缺血组（n=10）预处理组（n=10）F值P值TNF-α 1.33±0.20 2.68±0.24 1.52±0.21 113.060＜0.001 IL-6 1.23±0.25 2.86±0.37 1.63±0.08 105.190＜0.001

3 讨论

视网膜缺血再灌注损伤为常见眼科疾病，临床表现为血液再通后视网膜严重损伤，视功能显著下降。右美托咪定为高选择性与特异性的α2肾上腺素能受体激动剂，广泛应用于围术期及ICU中，具有抑制交感神经活性、镇静镇痛、抗焦虑与催眠等功效。围术期给予右美托咪定能维持机体血流动力学稳定，降低心脏以外风险。缺血再灌注损伤表现为电生理生化与形态等变化，最先发生的为电生理变化，ERG为视觉电生理中代表性部分，是客观评价视功能成熟有效的无创方式。视网膜缺血再灌注损伤预防目的是延缓或阻止视神经细胞死亡，防止视功能继续损失，故在神经保护药物中对视功能评估极为重要［6］。ERG的a波来自于感受器层，反映视网膜光感受器电位变化，b 波集中反映视网膜双极细胞与Muller细胞电活动；且视网膜各层，尤其是颗粒细胞层细胞均参与b 波形成。研究显示［7］，视网膜缺血先影响b波，b波组织对缺血影响比a波产生更明显。缺血组ERG 的a、b 波振幅均降低，且随着时间延长而持续性下降，提示缺血再灌注后对视网膜功能损伤在持续，该部分损伤是因恢复血供的再灌注损伤导致。预处理组ERG 的a、b 波有所上升，说明右美托咪定对视网膜缺血再灌注损伤后有保护作用。视网膜为神经组织，血供来源于视网膜中央动脉，该动脉为终动脉，视网膜极易在缺血情况下受损。视网膜缺血再灌损伤机制较为复杂，为多因素作用结果，包括细胞内钙超载、氧自由基损伤、细胞凋亡坏死及炎症反应等病理生理过程［8］。细胞凋亡包括外源性或死亡受体途径和内源性或线粒体途径导致的细胞凋亡，前一途径是细胞通过激活死亡受体接受接头蛋白Fas 相关死亡结构域蛋白，招募激活半胱氨酸蛋白酶以启动细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶在凋亡信号下，开放线粒体膜上通道，释放内部细胞色素与半胱氨酸蛋白酶前提蛋白，激活其核酸酶或抑制胞内抗凋亡蛋白，进而诱发细胞凋亡［9］。细胞色素c为线粒体呼吸链重要组成，释放于胞浆中能激活半胱氨酸蛋白酶9，使该酶3 激活以诱发细胞凋亡。研究显示［10］，抑凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax 比值与细胞凋亡密切相关。大鼠视网膜缺血再灌注损伤能使视网膜神经节细胞凋亡，促进凋亡蛋白Bax表达上调，抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调。由于内质网应激诱导细胞凋亡是通过Bcl-2家族调控实现，故可将内质网应激诱导细胞凋亡认为内源性或线粒体途径的细胞凋亡。本研究中健康组Bcl-2显著低于缺血组，缺血组Bcl-2显著低于预处理组，提示右美托咪定能通过抑制细胞凋亡以减轻大鼠视网膜缺血再灌注损伤。本研究显示，相对于健康组，模型组TNF-α及IL-6等炎症因子水平显著上升，说明视网膜缺血再灌注时机体组织产生大量炎症因子，出现炎症反应。相对于缺血组，预处理组视网膜组织中TNF-α及IL-6水平明显降低，提示右美托咪定能抑制炎症因子分泌，减弱大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型中炎症反应。

综上所述，右美托咪定可能通过促进Bcl-2 表达，抑制Bax 表达以改善细胞凋亡指数，同时能够抑制TNF-α、IL-6表达，降低视网膜缺血再灌注损伤炎症效应，进而为改善视网膜缺血再灌注损伤发挥保护作用。