hsa_circ_0006988诱导胶质瘤细胞铁死亡的机制研究

赵水强 孟大伟 陈国强 李亮亮 王志文 胡甜甜 牛建星

北京航空总医院神经外科，北京 100012

胶质瘤属于神经系统恶性肿瘤，手术切除、放疗、化疗等常见治疗手段虽然能够在一定程度上缓解胶质瘤进展，但治疗后的多数患者生存时间低于5 年，寻找有效方法抑制胶质瘤具有重大研究价值[1-2]。铁死亡是近些年来发现的细胞程序性死亡，氧化应激、Fe2+含量增多是其较为典型的特征，诱导肿瘤细胞铁死亡也成为肿瘤治疗中的研究热点[3-4]。circRNA 是高度稳定的非编码RNA，其是由前体RNA 经过反向剪接而产生的，circRNA 在人体内的多种组织中表达，并且有多种生物学功能[5-6]。研究证明[7-8]，肿瘤的进展也受到circRNA 的表达调控，靶向改变circRNA 的表达可能是肿瘤治疗的潜在途径之一。既往文献[5]显示，hsa_circ_0006988（circ_0006988）促进非小细胞肺癌细胞增殖，诱导肿瘤生长。目前尚未发现circ_0006988在胶质瘤细胞铁死亡中的作用研究。Nrf2/GPX4 信号可增加机体抗氧化能力，参与氧化应激、铁死亡、肿瘤等生理、病理过程[9-11]。本实验探讨下调hsa_circ_0006988 作用于Nrf2/GPX4 信号诱导胶质瘤细胞铁死亡的机制，为胶质瘤靶向基因治疗提供参考思路，为研究胶质瘤分子发生机制提供数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

脑正常胶质细胞HEB（BNCC358606），购自上海抚生实业有限公司；胶质瘤细胞A172（货号：CL0016），武汉普诺赛生命科技有限公司；胶质瘤细胞SHG44（货号：CTCC-007-0459），购自湖南丰晖生物科技有限公司；胶质瘤细胞CHG-5（货号：YS1481M），购自美 国ATCC；siRNA control、circ_0006988 siRNA、Nrf2 siRNA、阴性对照载体（pcDNA）、Nrf2 过表达载体（pcDNA-Nrf2），湖南普拉特泽生物科技有限公司提供；兔抗转铁蛋白受体（trasferrin-receptor，TFR）抗体（货号：ab185550）、兔抗Ferritin 抗体（货号：ab75973）、兔抗Nrf2 抗体（货号：ab62352），兔抗转铁蛋白（Trans ferrin,TF）抗体（货号：ab277635），Fe2+检测试剂盒（货号：ab83366）购自美国Abcam；兔抗GPX4 抗体（货号：MABS1274）购自美国Sigma 公司；cDNA 第一链合成试剂盒（货号：K1622）、ROS 测定试剂盒（货号：E004-1-1），购自北京百奥莱博科技有限公司；MDA测定试剂盒（货号：A003-3-1），购自北京中昊新生科技有限责任公司；荧光定量PCR 试剂盒SYBR Green qPCR Mix（货号：MCE HY-K0501），购自天津迈基生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 胶质瘤细胞CHG-5 培养参数设置为37℃，5%CO2，细胞培养在添加有10%胎牛血清的RPMI1640 细胞培养液中。胶质瘤细胞CHG-5 分为Control 组、si-NC 组、si-circ 组、si-Nrf2 组、si-circ+Vector 组、si-circ+Nrf2 组，Control 组为空白对照，si-NC组、si-circ 组、si-Nrf2 组细胞分别转染siRNA Control组、circ_0006988 siRNA 组、Nrf2 siRNA 组，si-circ+Vector 组细胞共转染circ_0006988 siRNA、阴性对照载体，si-circ+Nrf2 组细胞共转染circ_0006988 siRNA、Nrf2 过表达载体。细胞转染操作方法完全根据Lipofectamine 2000 说明书进行。

1.2.2 qRT-PCR 方法检测circ_0006988 表达 收集脑正常胶质细胞HEB 和胶质瘤细胞A172、SHG44、CHG-5，或者收集按照“1.2.1”中方法分组（Control 组、si-NC 组、si-circ 组）处理24 h 后的细胞，经PBS 洗涤2 次后，用Trizol 试剂提取总RNA，cDNA第一链合成试剂盒反转录，荧光定量PCR 试剂盒SYBR Green qPCR Mix 进行荧光定量PCR。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环；设置GAPDH 作为参照，结果按照2-△△Ct法计算目的基因的表达变化。PCR 引物序列，circ_0006988 正向引物：5’-CTGCAACGTCACCTACAACG-3’，circ_0006988 反向引物：5’-CACCACCAG-CACAAAAATGA-3’；GAPDH 正向引物：5’-CTCCTCCACCTTTGACGCT-3’，GAPDH 反向引物：5’-GGGTCTCTCTC-TTCCTCTTGTG-3’。

1.2.3 比色法检测Fe2+收集按照“1.2.1”中方法分组处理24 h 后的胶质瘤细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，添加4 倍体积的铁检测缓冲液，4℃，16 000 g 离心10 min，吸取上清备用。吸取50 μl 上清液添加到96 孔板，再补充50 μl 的Fe2+分析缓冲溶液，然后继续添加5 μl 的分析缓冲液，放在25℃孵育30 min。把100 μl 的Fe2+探针加入测试孔或标准品孔内，在25℃孵育30 min。酶标仪测定593 nm 的OD值。然后根据标准曲线计算Fe2+含量。

1.2.4 Western blot 检测Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表达 收集按照“1.2.1”中方法分组处理24 h 后的胶质瘤细胞，加入蛋白提取试剂，细胞刮刀收集细胞，4℃，12 000 g 离心10 min，吸取蛋白上清备用。配制10%的分离胶、5%的浓缩胶。蛋白样品在添加到样品孔之前，首先需要与5×Loading Buffer 混合煮沸5 min。每个孔内添加蛋白量为40 μg。80 V 电压电泳20 min，100 V 电压电泳1 h。PVDF 膜放在甲醇中活化，100 V 电压转膜2 h。PVDF 膜经过5%脱脂奶粉将非特异性的结合位点封闭以后，放在稀释以后的一抗（Nrf2、TFR 按照1∶1 000 稀释，GPX4、Ferritin、TF 抗体按照1∶800 稀释）溶液中，4℃孵育12 h。PVDF膜放在稀释后的抗溶液中，室温结合2 h。ECL 显色，显影。Image J 分析条带的灰度值，根据灰度值计算目的蛋白的表达差异，GAPDH 作为参照。

1.2.5 ROS、MDA 检测 收集按照“1.2.1”中方法分组处理24 h 后的胶质瘤细胞，利用ROS 测定试剂盒（DCFH-DA 法）、MDA 测定试剂盒（硫代巴比妥酸法）检测ROS、MDA 水平。ROS 结果以相对荧光强度表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_0006988 在胶质瘤细胞的表达

胶质瘤细胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988表达水平高于脑正常胶质细胞HEB（P＜0.05）；胶质瘤细胞A172、SHG44 中circ_0006988 表达水平低于胶质瘤细胞CHG-5（P＜0.05）。circ_0006988 在胶质瘤细胞中表达上调，选择表达水平最高的胶质瘤细胞CHG-5 进行后续实验。见表1。

表1 脑正常胶质细胞HEB 和胶质瘤细胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988 表达水平（，n=9）

表1 脑正常胶质细胞HEB 和胶质瘤细胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988 表达水平（，n=9）

注 与HEB 比较，aP＜0.05；与CHG-5 比较，bP＜0.05

2.2 下调circ_0006988 对胶质瘤细胞铁死亡的作用

si-circ 组胶质瘤细胞中，Fe2+含量、ROS、MDA 含量高于Control 组、si-NC 组，Ferritin、TF、TFR 蛋白表达高于Control 组、si-NC 组（P＜0.05）。见图1～2、表2。

图1 Western blot 检测circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤细胞Ferritin、TF、TFR 蛋白表达差异

图2 DCFH-DA 法检测ROS 含量（200×）

表2 circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤细胞中circ_0006988 表达水平和Ferritin、TF、TFR 蛋白表达及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

表2 circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤细胞中circ_0006988 表达水平和Ferritin、TF、TFR 蛋白表达及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

注 与Control 组比较，aP＜0.05；与si-NC 组比较，bP＜0.05。ROS：活性氧；MDA：丙二酸

2.3 下调circ_0006988 抑制胶质瘤细胞中Nrf2/GPX4信号激活

si-circ 组胶质瘤细胞中Nrf2、GPX4 蛋白表达低于Control 组、si-NC 组（P＜0.05）。见图3、表3。

图3 Western blot 检测circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤细胞中Nrf2/GPX4 信号蛋白表达

表3 circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤细胞中Nrf2、GPX4 蛋白表达水平（，n=9）

表3 circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤细胞中Nrf2、GPX4 蛋白表达水平（，n=9）

注 与Control 组比较，aP＜0.05；与si-NC 组比较，bP＜0.05

2.4 激活Nrf2/GPX4 信号逆转下调circ_0006988 对胶质瘤铁死亡作用

si-circ 组胶质瘤细胞Nrf2、GPX4 蛋白表达低于si-NC 组，Fe2+含量，Ferritin、TF、TFR 蛋白表达，ROS、MDA 含量高于si-NC 组（P＜0.05）；si-circ+Nrf2 组胶质瘤细胞Nrf2、GPX4 蛋白表达高于si-circ+Vector组，Fe2+含量，Ferritin、TF、TFR 蛋白表达，ROS、MDA含量低于si-circ+Vector 组（P＜0.05）。见图4～5、表4。

图4 Western blot 检测Nrf2 过表达载体、circ_0006988 siRNA共转染后胶质瘤细胞中Nrf2、GPX4、TF、TFR、Ferritin 蛋白表达变化

表4 Nrf2 过表达载体、circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表达及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

表4 Nrf2 过表达载体、circ_0006988 siRNA 转染后胶质瘤Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表达及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

注：与si-NC 组比较，aP＜0.05；与si-circ+Vector 组比较，bP＜0.05。ROS：活性氧；MDA：丙二醛

3 讨论

研究circRNA 在胶质瘤中的作用，对于基因靶向治疗胶质瘤具有重要意义[12-15]。文献显示[8]，circ_0006988在非小细胞肺癌中表达上调，并且circ_0006988 可促进肿瘤细胞增殖，circ_0006988 可能是肿瘤促进因子。本实验显示，胶质瘤细胞中circ_0006988 表达水平高于正常胶质细胞，并且下调circ_0006988 抑制胶质瘤细胞增殖，circ_0006988 可能具有促进胶质瘤进展的功能，这与之前的研究报道结果一致，均说明circ_0006988 可能发挥类似癌基因的作用。

铁死亡表现为脂质过氧化物积累、氧化应激[10-11]。MDA、ROS 含量变化可间接反映氧化应激水平和铁死亡变化[12-13]。Ferritin、TF、TFR 是与铁死亡有关的蛋白调控因子，Ferritin、TF、TFR 在铁死亡中过表达[14-15]。本实验发现，下调circ_0006988 后的胶质瘤细胞中Fe2+含量增加，ROS、MDA 水平增加，Ferritin、TF、TFR 蛋白表达增多，提示下调circ_0006988 促进胶质瘤细胞铁死亡，这可能是circ_0006988 调控胶质瘤进展的重要原因之一。Nrf2 是机体多种解毒酶的激活因子，在细胞受到损伤时，Nrf2 表达上调促进细胞增加抗氧化能力，减轻细胞损伤[16-17]。研究显示[18-20]，Nrf2 能够诱导GPX4 表达，而GPX4 也被认为是铁死亡的核心，抑制GPX4 能够加快细胞氧化应激和铁死亡。本研究显示，下调circ_0006988 降低了胶质瘤细胞中Nrf2、GPX4 表达水平，且抑制Nrf2/GPX4 信号降低胶质瘤细胞增殖能力，提高细胞中Fe2+、ROS、MDA 水平，促进Ferritin、TF、TFR 蛋白表达，并且下调circ_0006988 可能通过抑制Nrf2/GPX4 信号诱导胶质瘤细胞铁死亡[21-25]。进一步用逆转实验验证发现，激活Nrf2/GPX4 信号部分逆转了下调circ_0006988 对胶质瘤细胞增殖、铁死亡的作用，这提示下调circ_0006988 通过抑制Nrf2/GPX4 信号诱导胶质瘤细胞铁死亡，抑制细胞增殖。

综上，circ_0006988 在胶质瘤中可能发挥促进作用，靶向抑制circ_0006988 可能是胶质瘤治疗的途径之一，下调circ_0006988 可在体外诱导胶质瘤细胞铁死亡，作用机制与抑制Nrf2/GPX4 信号有关，这为研究circ_0006988 在胶质瘤中的作用机制提供了参考，为胶质瘤的分子靶向治疗提供了参考方向。

图5 DCFH-DA 法检测ROS 含量（200×）