不同浓度二甲基亚砜对细粒棘球蚴原头节生长的影响

李芳芳，王勃，崔仁杰，陈志广，吕海龙

1.陇南市第一人民医院消化内科，甘肃陇南 746000；2.成都市第三人民医院肝胆外科，四川成都 610504

二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）是一种含硫有机化合物，经常被作为许多药物的溶剂而被广泛应用，目前在细胞的培养过程中研究得出其终浓度＜0.1%时，对细胞的生长无明显影响，细粒棘球蚴是一种原始的多细胞生物，其由于结构复杂因此药物使用量通常要高于单细胞生物。因此在实验过程中当药物用量较大、药物溶解度较低时，0.1%的DMSO 所溶解的药物往往达不到实验需求。但是对于DMSO 在细粒棘球蚴原头节所能耐受的最高浓度方面尚无明确研究。

因此本研究自2020 年1 月—2022 年6 月陇南市第一人民医院联合石河子大学课题组收集并体外培养的自然感染的原头节，选取不同浓度的DMSO 体外作用，观察其对原头节生长作用的影响，初步探讨原头节生长所能耐受的最高浓度，为以后的研究提供新的支撑依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

细粒棘球蚴原头节：自然感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏，由新疆石河子市西部牧业公司提供。培养基为含10% 小牛血清的RPMI 1640，在37℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d 更换培养基一次。二DMSO 购自Sigma 公司，RPMI 1640 培养基购自上海哈灵生物科技有限公司，Caspase-3 试剂盒购自北京普利莱（APPLYGEN）基因技术有限公司，37℃、5%CO2恒温培养箱（Nuaire 公司），奥林帕斯IX71 荧光倒置显微镜Olympus optical 公司。

1.2 方法

伊红染色法测定细胞存活率取原头节接种后，本研究将DMSO 在培养基中浓度调整为0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，每组设4 个复孔,实验重复3 次。对照组不加DMSO。在37℃、10%O2、5%CO2条件下培养。培养48 h 分别从各组均匀抽取约100～150 个原头节（移液枪混匀后需150～200 μL 混合液），置于EP 管中静置取含原头节的培养基与0.1%伊红与头节按1∶1 等体积混合涂于载玻片，静置15 mim 后待伊红与头节充分接触后压片并于倒置显微镜下观察原头节的形态及活力变化。在光学显微镜下根据颜色的变化观察原头节的活力，活的细粒棘球蚴原头节活动性较好，则拒染不会被着红色；死亡的或活力差的原头节将会被染成红色，并伴有某些结构的破坏，观察活力并计数。

取上述浓度作用48 h 后原头节，PBS 冲洗，弃上清液后按每1 mg 原头节：裂解液50 μL 的比例混匀，在超声粉碎仪下超3 次，15 s/次。用Bradford 法测定各组蛋白浓度，并配平蛋白浓度。将各样品依据说明书加入96 孔酶标板，避光37℃恒温孵育箱动态观察，当蛋白液颜色明显出现黄色时，BIO-RAD酶标仪检测其各组在A405处的吸光度值。根据相应的标准曲线并借助相关软件求得ρNA 的浓度。

分别取0.5%、1.0%DMSO 作用48 h 后的细粒棘球蚴原头节，同时RPMI 1640 为空白对照组，取样品用PBS 洗涤（方法同上），将洗干净的头节用4%戊二醛中固定，过夜使充分作用。重复ddH2O 洗涤3次，用浓度逐渐增加的丙酮逐级梯度脱水，50%（5 min）、70%（10 min）、80%（10 min）、90%（10 min）、100%（10 min）。离心弃上清2%的琼脂糖包埋，室温下冷却至凝固后放入4%戊二醛内固定过夜。环氧树脂（Epon812）包埋、固定。在赖克特和荣格（LKB2088V）型超薄切片机切片（厚度为1～2 μm 厚的薄切片），醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，置于日本会株投射电子显微镜（型号JEOL 1230）上在80 kV条件下观察原头节内部超微结构的变化。

1.3 观察指标

伊红染色并观察不同浓度DMSO 作用组原头节后48 h 活力并计数，不同浓度的DMSO 对原头节体内Caspase-3 酶活性影响的测定，投射电子显微镜观察原头节内部超微结构改变。

1.4 统计方法

运用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间差异比较进行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度DMSO 对细粒棘球蚴原头节生长的存活率对比

0.5%的DMSO 作用原头节48 h 后，原头节存活率仍为（89.3±1.24)%与空白对照组原头节存活率（91.2±2.17）%对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；但浓度为1.0%、2.0%DMSO 作用原头节48 h 后，其存活率分别为（55.3±1.13）%、（41.7±1.24）%，其存活率明显低于空白对照组，差异有统计学意义（t=8.726、9.217，P＜0.05）。见表1。

表1 DMSO 作用48 h 后细粒棘球蚴原头节的存活率对比[(±s)，%]

表1 DMSO 作用48 h 后细粒棘球蚴原头节的存活率对比[(±s)，%]

注：▼P＜0.05，与空白对照组相比

组别空白对照组0.1%DMSO 0.2%DMSO 0.5%DMSO 1.0%DMSO 2.0%DMSO作用48 h 后细粒棘球蚴原头节存活率91.2±2.17 90.4±1.19 88.4±2.06 89.3±1.24（55.3±1.13）▼（41.7±1.24）▼

2.2 不同浓度DMSO 对原头节内Caspase-3 酶活性表达的对比

结果显示1.0%、2.0%浓度的DMSO 作用组原头节内Caspase-3 的活性表达明显较空白对照组及0.1%、0.2%、0.5% 增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；作用48 h 时2.0%DMSO 组Caspase-3 的活性表达最强（53.331±0.572）μmol/L，同样1.0%DMSO 作用组的原头节体内Caspase-3 的活性也呈增强趋势。见表2。

表2 不同浓度DMSO 作用48 h 后各组Caspase-3 酶活性对比[(±s)，μmol/L]

表2 不同浓度DMSO 作用48 h 后各组Caspase-3 酶活性对比[(±s)，μmol/L]

注：▼P＜0.05，与空白对照组相比

组别空白对照组0.1%DMSO 0.2%DMSO 0.5%DMSO 1.0%DMSO 2.0%DMSO作用48 h 后Caspase-3 8.275±0.617 11.004±0.217 13.203±0.612 19.903±0.562（45.658±0.627）▼（53.331±0.572）▼

2.3 不同浓度的DMSO 对体外细粒棘球蚴原头节内部超微结构的影响

空白对照组原头节内部超微结构显示清楚，囊泡排列较规则，合胞体带致密，微毛排列整齐（图1A）。0.5%DMSO 作用原头节48 h 后，与空白对照组比较，原头节结构未发生明显变化，未见明显损害（图1B）。而1.0%DMSO 作用细粒棘球蚴原头节48 h 后，原头节表现出不同程度的损害，合胞体带结构较空白对照组松散，并出现微毛排列紊乱（图1C）。2.0%DMSO 组作用于细粒棘球蚴原头节48 h后，头节表面微毛紊乱，部分断裂并脱落，合胞体带更疏松（图1D）。

图1 DMSO 作用后细粒棘球蚴原头节内部结构的变化

3 讨论

在实验研究中，许多药物都需要有相关溶剂载体溶解后才能用于实验中，最常见的溶剂是水，但是脂溶性药物或者水溶性较差的药物就需要相关溶剂作为溶媒，DMSO 就是一种应用广泛且最常见的有机溶剂[1-2]。DMSO 无色黏稠，是一种既溶于水又溶于有机物的极为重要的非质子极性溶剂，有“万能溶媒之称”，其作为各种细胞的低温冻存保护剂、药物溶剂而广泛应用于各种实验研究[3-4]。

本研究结果中伊红染色后倒置显微镜下观察，0.1%～0.5%的DMSO 作用细粒棘球蚴原头节后，细胞存活率变化不明显，0.5%～1.0%的DMSO 作用后，随浓度增加和时间延长，细胞存活率逐渐下降。有研究证实，对于细胞所能耐受的最大浓度为0.1%[5]，即在细胞培养过程中其在培养基中的终浓度小于0.1%时，不影响细胞的生长及代谢，而浓度高于2.0%时出现细胞生长抑制，有明显的杀死细胞的作用。例如，有研究用不同浓度的DMSO 作用Min6 胰岛细胞，发现其浓度＜0.125%时对Min6 细胞生长周期及遗传物质的合成无明显影响[6]，＞0.25%时对细胞的存活有抑制作用[7]。

但是不同的细胞所能耐受的浓度可能会存在差异，可能与细胞的类别相关。贺兵等[8]用不同浓度的DMSO 作用兔软骨细胞，发现在0.1%～1.0%浓度范围内作用很小，产生的影响可以忽略。同样有报道对于Hela 细胞，只有DMSO 的浓度与培养基体积比达到1∶1 时，才能到抑制细胞增殖的作用[9]。因此不同的细胞所能耐受的DMSO 的浓度不尽相同，因此在实验过程中DMSO 作为溶剂时所产生的影响是不能忽略的。

细粒棘球蚴原头节是细粒棘球绦虫虫卵寄生在人和羊等中间宿主体内，感染机体器官后所产生的囊内容物。其治疗目前还是以手术为主[10-13]，但是对于失去手术机会的患者以及各种原因导致的无法手术疗的病患，药物治疗即最终的选择[14]。

肝包虫的药物治疗是当今研究的热点[15]，因此有多种药物及制剂被广泛应用于试验及临床研究中，所以随之而来的问题就是溶媒的选择，DMSO 在细粒棘球蚴原头节的实验研究中亦被广泛应用[16-18]，但是对于原头节的最高耐受浓度没有明确的研究，统一选择细胞的标准终浓度＜0.5%为安全范围。

然而，细粒棘球蚴原头节是一种多细胞原始微生物，所需的药物剂量要高于单细胞生物。当药物溶解度较低、药物剂量较大时可能达不到实验所需。因此本实验设不同浓度梯度的DMSO 作用原头节。通过检测相关指标而判断不同浓度所产生的影响，确定一个相对安全的剂量范围为肝包虫药物研究提供新支撑依据。

Caspase-3 为细胞凋亡的关键执行分子[19]，有研究发现DMSO 通过激活Caspase-3 而引起人肺癌细胞系A549 细胞凋亡[20]，透射电子显微镜观察细胞内部结构改变判定细胞的凋亡仍然是最可靠的方式[21]。

从实验结果得知DMSO 作用细粒棘球蚴原头节48 h 后，1.0%、2.0%DMSO 组的Capase-3 酶活性分别为（45.658±0.627）μmol/L 和（53.331±0.572）μmol/L，明显高于对照组（8.275±0.617）μmol/L。有学者报道0.5%DMSO 作用细粒棘球蚴原头节48 h 后Capase-3 活力表达为（18.483±0.852）μmol/L 与本研究对照组中0.5%DMSO 组处理48 h 后Capase-3 活力表达值（19.903±0.562）μmol/L 结果对比，差异无统计学意义（P＞0.05）[22]。透射电镜显示高浓度组出现了微毛排列紊乱、减少、断裂、脱落，合胞体带疏松等细胞凋亡特征性改变[23-24]。

综上所述，用不同浓度的DMSO 作用原头节后的相关结果可知，在0.1%～0.5%的范围内与对照组原头节无明显变化，此范围内可忽略其对细胞产生的影响。