二甲双胍对H9C2 心肌细胞肥大的改善作用及其机制

黄德盛, 赵亚楠, 陈 云, 孙艺瑶, 覃伟林, 刘谋杰, 谢菊华

（1.沈阳医学院组织胚胎学教研室，辽宁 沈阳 110034；2.中国医科大学附属第一医院心内科，辽宁 沈阳 110034）

心肌细胞肥大是心肌细胞对伤害性刺激的代偿性反应。在成年人心脏中，心肌细胞再生能力有限，每年的周转率不足1%，因此在心脏容量超负荷等刺激下，心肌细胞无法通过细胞增殖适应压力性应激，而是通过形态学增大来维持心脏泵血功能［1］。目前临床上尚缺乏特效药物治疗心肌细胞肥大。二甲双胍是临床糖尿病治疗的一线用药，研究［2-3］显示：二甲双胍在降低血糖水平的同时还具有改善心肌细胞肥大、抑制动脉粥样硬化及降低心肌梗死后心衰发生率或死亡风险等心血管保护作用，但其具体机制尚未完全阐明。

心脏是人体能量高需求器官，心肌细胞中的线粒体约占整个细胞的1/3［4］。且线粒体并非孤立的，而是相互联通、处于分裂和融合平衡中，即线粒体动力学平衡［5-7］。与线粒体分裂有关的蛋白主要为动力相关蛋白1 （dynamin-related protein 1，Drp1），与线粒体融合有关的标志性蛋白主要有神经萎缩蛋白1 （optic atrophy 1，OPA1）、线粒体融合蛋白（mitofusin，MFN）1 和MFN2，分别介导线粒体内膜和外膜的融合，以连接线粒体和稳定膜电位，发挥细胞功能［8-9］。研究［10］发现：上调糖尿病心肌病大鼠心肌组织中OPA1 蛋白的表达可增加线粒体融合、恢复线粒体功能并改善心脏功能，提示加强线粒体融合可以作为治疗心肌疾病的潜在治疗策略。

临床流行病学调查［11］显示：未接受二甲双胍治疗的2 型糖尿病患者白细胞中总活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和线粒体中ROS 水平均明显升高，线粒体膜电位降低，MFN1、MFN2 和OPA1 mRNA 及蛋白表达水平降低。同时动物实验［12］发现：二甲双胍能够通过调控线粒体动力学平衡和改善大鼠心肌缺血再灌注损伤的线粒体功能发挥心脏保护作用。为深入了解二甲双胍的心脏保护作用及其可能的分子机制，本研究通过异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）作用于H9C2 心肌细胞以建立心肌细胞肥大模型，探讨二甲双胍对ISO 诱导的H9C2 细胞中线粒体形态及主要融合蛋白OPA1 和MFN2 的影响，为二甲双胍对心血管疾病的多重保护作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器H9C2 心肌细胞 （中国科学院上海细胞库提供）。低糖DMEM 和特级胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自美国Hyclone 公司，ISO 购自美国Sigma 公司。CO2培养孵箱购自美国Thermo Fisher 公司，正置荧光显微镜和组织切片机购自德国Leica 公司，实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 心肌细胞肥大模型制备、细胞分组和处理无菌操作下培养H9C2 细胞。待细胞已铺满培养皿底，可传代培养或冻存。细胞生长密度为约50%～70%时，弃去原培养液，饥饿处理24 h 后，对照组细胞不给予特殊处理，部分细胞给予50 μmol·L－1ISO 干预细胞24 h 作为ISO 组，建立心肌细胞肥大模型。Western blotting 法检测2 组H9C2 细胞中脑纳肽（brain natriuretic peptide，BNP）蛋白表达水平以验证细胞模型，BNP 蛋白表达水平升高即为造模成功［13］。ISO 处理同时给予2 mmol·L－1二甲双胍作用0.5 h、1.0 h、4.0 h、8.0 h 和24.0 h，分别收集细胞或直接保存以进行后续相应实验。将细胞分为对照组、ISO 组、ISO+二甲双胍组和二甲双胍组。

1.3 CCK-8 法检测各组细胞活力细胞接种4～6 h 后在细胞培养液中加入1/10 体积的CCK-8 溶液，充分混匀后于37 ℃恒温箱内培养30 min。酶标仪于波长450 nm 处检测各孔吸光度（A）值，操作时注意避免气泡产生，每组3～5 个复孔，取平均值计算各组细胞活力。细胞活力= ［实验组A 值－空白组A 值）］/［对照组A 值－空白组A 值］×100%。

1.4 结晶紫染色观察各组心肌细胞形态表现和横截面积于12 孔细胞培养板中接种细胞，各组细胞给药结束后采用4%多聚甲醛固定1 h。随后滴加1%结晶紫，室温静置2 h，显微镜下拍照并记录，观察各组心肌细胞形态表现。每孔随机选取5 个视野，每个视野随机选取10 个H9C2 细胞，采用Image J 软件分析各组心肌细胞横截面积，并取平均值。

1.5 RT-qPCR 法检测各组心肌细胞中心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）mRNA 表达水平

PCR 引物均由北京鼎国采用Primer 5.0 设计并合成。提取各组细胞总RNA，采用核酸分析仪检测波长260 nm 和280 nm 处的A 值以检测RNA 纯度。反转录为cDNA，并根据RT-qPCR 试剂盒说明书配制反应体系。ANP 引物序列：上游引物，5′-CCTGGACTGGGGAAGTCAAC-3′；下游引物，5′-GTCAATCCTACCCCCGAAGC-3′；GAPDH上游引物，5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物，5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用 2－ΔΔCt法计算目的基因mRNA 表达水平。

1.6 线粒体荧光探针观察各组心肌细胞线粒体形态表现细胞给予药物处理后，根据说明书配制 1 mmol·L－1Mito-Tracker Green 储存液。取37 ℃预热的1∶5 000 比例Mito-Tracker Green 储存液加入至细胞培养液，共孵育30 min。去除染色工作液后加入新鲜培养液并采用荧光显微镜观察各组细胞线粒体形态表现。镜下线粒体呈明亮的强绿色荧光。

1.7 Western blotting 法检测各组心肌细胞中OPA1 和MFN2 蛋白表达水平将提取的H9C2 细胞或冻存的心肌组织置入蛋白裂解液内提取蛋白。采用BCA 法测定蛋白浓度。依次配制SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，上样、电泳、转膜和封闭，随后一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育1.0～1.5 h，ECL 发光显色，并采用Image J 软件分析各蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.8 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组H9C2 细胞横截面积和细胞活力，H9C2 细胞中ANP mRNA 表达水平及BNP、OPA1 和MFN2 蛋白表达水平均符合正态分布，以±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌细胞肥大模型鉴定50 μmol·L－1ISO 作用于H9C2 细胞24 h 后，与对照组［（1.00±0.11）和（1.00±0.04）］比较，ISO 组细胞横截面积［（1.71±0.10）］增加（P＜0.05），细胞中BNP 蛋白表达水平（1.96±0.22）升高（P＜0.05），提示50 μmol·L－1ISO 作用于H9C2 细胞24 h 可以成功建立心肌细胞肥大模型。见图1 和2。

图1 ISO 处理后2 组H9C2 心肌细胞形态表现（结晶紫，×400）Fig.1 Morphology of H9C2 cardiomyocytes in two groups after treated with ISO(Crystal violet,×400)

图2 2 组H9C2 细胞中BNP 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of BNP protein in H9C2 cells in two groups

2.2 各组心肌细胞活力CCK-8 法检测各组心肌细胞活力结果显示：二甲双胍作用8 h 时，细胞活力恢复效果最佳，故选取2 mmol·L－1二甲双胍，作用时间为8 h。见图3。

图3 各组H9C2 心肌细胞活力Fig.3 Viabilities of H9C2 cardiomyocytes in various groups

2.3 各组心肌细胞中ANP mRNA 表达水平和线粒体形态表现RT-qPCR 法检测结果显示：与对照组比较，ISO 组细胞中ANP mRNA 表达水平升高（P＜0.05）。与ISO 组比较，二甲双胍+ISO 组和二甲双胍组细胞中ANP mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。见图4。线粒体荧光探针检测结果显示：对照组细胞中线粒体呈绿色荧光，多为短棒状，少数线粒体丝线状相连；与对照组比较，ISO 组H9C2 细胞中点状线粒体明显增加，ISO+二甲双胍组和二甲双胍组细胞中点状线粒体明显减少。见图5。

图4 各组H9C2 心肌细胞ANP mRNA 表达水平Fig.4 Expression levels of ANP mRNA in H9C2 cardiomyocytes

图5 各组H9C2 心肌细胞线粒体形态表现（Bar=5 μm）Fig.5 Morphology of mitochondrium in H9C2 cardiomyocytes in various groups （Bar=5 μm）

2.4 各组心肌细胞中OPA1 和MFN2 蛋白表达水平与对照组比较，ISO 组细胞中线粒体融合标志性蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与ISO 组比较，ISO+二甲双胍组和二甲双胍组细胞中OPA1 和MFN2 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见图6。

图6 各组细胞中OPA1 和MFN2 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B，C）Fig.6 Electrophoregram(A) and histograms(B,C) of expressions of OPA1 and MFN2 proteins in cells in various groups

3 讨 论

心肌细胞肥大一般可分为生理性和病理性心肌细胞肥大。生理性心肌细胞肥大一般发生在运动员和孕妇人群，其主要特征是一旦刺激缓解，心肌细胞肥大是可逆的［14］。而病理性心肌细胞肥大则是心肌细胞不可逆的病理性重塑，如高血压和慢性瓣膜疾病所导致的心肌细胞肥大，易增加患者不良心血管事件的风险，严重者可诱发心力衰竭［15］。因此，有效改善或减轻病理性心肌细胞肥大对高血压和慢性瓣膜疾病等疾病的治疗有重要意义，同时构建简单易操作且成功的心肌细胞肥大体内外模型对常见心血管疾病的基础研究和临床防治较为重要。本研究结果显示：H9C2 细胞横截面积明显增加是心肌细胞肥大最常见指标之一，BNP 蛋白表达水平升高提示ISO 作用H9C2 细胞24 h 可以成功模拟心肌细胞肥大，为后续心肌细胞肥大的发病机制及药物干预研究提供了基础。

线粒体是心肌细胞能量产生的重要场所，在调节细胞内信号转导和维持细胞稳态等方面发挥了重要作用。线粒体功能障碍与高血压和动脉粥样硬化等常见心血管疾病有密切关联［16-18］。本课题组前期研究［19］发现：自发性高血压心肌细胞肥大大鼠线粒体膜电位降低，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α 表达下调，表明心肌细胞肥大与线粒体功能失调有关，维持线粒体功能和稳态对改善心肌细胞肥大具有重要意义。但心肌细胞中线粒体相互联通，保持高度动态的线粒体动力学平衡［20-22］。通过融合分裂，线粒体可以在细胞内根据需求重新分布，满足细胞的各种能量及生物信号转导需求，保障细胞新陈代谢和生物体正常运转。

线粒体动力学平衡是维持心脏功能所必需的，该平衡被打破会导致线粒体结构改变及功能障碍，诱发各种心肌疾病［23-25］。研究［26-28］显示：线粒体动力学平衡失调在心力衰竭和缺血再灌注损伤等多种疾病的发生发展中发挥了重要作用。研究［29］发现：抑制线粒体动力相关蛋白的活性能够减少心肌梗死小鼠线粒体过度分裂而减轻梗死区域心肌纤维化，改善心脏功能。LIU 等［30］发现：上调糖尿病心肌病大鼠心肌组织中OPA1 蛋白的表达能增加线粒体融合，恢复线粒体功能，改善心脏功能。本研究结果显示：ISO 诱导的H9C2 细胞中点状线粒体明显增加，同时线粒体融合相关蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表达水平降低。提示ISO 诱导的H9C2心肌细胞肥大与心肌细胞线粒体融合减少有关。线粒体融合减少可能是ISO 诱导心肌细胞肥大的可能分子机制。

二甲双胍是临床糖尿病治疗的一线用药，近些年已被证实具有良好的心血管保护作用［31］。本研究结果显示：二甲双胍干预后，ISO 诱导的H9C2细胞中ANP mRNA 表达水平降低。给予二甲双胍后，ISO 诱导的H9C2 细胞中点状线粒体减少，线粒体融合相关蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表达水平升高。提示二甲双胍可能通过调控OPA1 和MFN2 蛋白表达，维持线粒体动力学平衡，从而减轻ISO 诱导的H9C2 心肌细胞肥大。

综上所述，二甲双胍对ISO 诱导的H9C2 心肌细胞肥大有改善作用，且其改善作用可能与上调OPA1 和MFN2 蛋白表达及促进心肌细胞线粒体融合有关。