lncRNA PAX8-AS1 对结直肠癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及其机制

闫圣玉, 刘昌化, 许志杰, 丁雅婷, 谢亚锋, 张 侨, 刘菀莹

（1.南华大学衡阳医学院附属第二医院肛肠科，湖南 衡阳 421000；2.南华大学衡阳医学院附属第二医院胃肠外科，湖南 衡阳 421001）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，其无特异临床表现且生存时间与确诊时疾病分期密切相关。CRC 在我国消化道肿瘤中发病率位于第3 位，且呈逐年上升的趋势。为了提高CRC 治疗效果、减少副作用并降低发生继发性肿瘤的风险，仍需寻找更好的治疗手段。因此针对CRC 发病特点的定点靶向治疗对CRC 的治疗和预后具有重要意义［1］。研究［2-3］发现：长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）参与CRC的发生发展，可介导CRC 细胞增殖、侵袭和转移。lncRNA 配对盒8 反义RNA 1 （lncRNA PAX8-AS1）在鼻咽癌和乳头状甲状腺癌组织中低表达，其过表达可抑制肿瘤细胞生长［4-5］。但也有研究［6］表明：PAX8-AS1 在非小细胞肺癌中过表达，其沉默可降低非小细胞肺癌的细胞增殖活性和迁移能力。PAX8-AS1 在CRC 组织中高表达，因此CRC细胞恶性生物学行为可能与PAX8-AS1 高表达有关联。微小RNA （microRNA，miRNA）作为一种长度为18～25 个核苷酸的单链非编码RNA，也参与了恶性肿瘤的不同过程，如在CRC 组织和细胞中，miR-22-3p 明显下调，miR-22-3p 能够通过介导RAS 癌基因家族成员RAP2B/磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （protein kinase B，Akt）通路明显抑制CRC细胞增殖和侵袭［7］。然而PAX8-AS1 是否通过miR-22-3p 介导CRC 的生物学行为尚未完全阐明。本研究探讨PAX8-AS1 和miR-22-3p 在CRC 细胞中表达及其对CRC 细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，并阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料选择2018 年7 月—2020 年12 月在南华大学衡阳医学院附属第二医院肛肠科行手术切除的94 例CRC 患者为研究对象，所有患者均经证实患有CRC，收集CRC 患者癌组织及对应癌旁组织（距癌灶边缘＞5 cm 取材）标本。根据国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）制订的TNM 分期第8 版标准［8］对CRC 患者进行临床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期35 例，Ⅲ～Ⅳ期59 例。

1.2 纳入和排除标准纳入标准：①初次诊断为CRC 者；②临床资料完整；③依从性较好者；④生存时间超过6 个月。排除标准：①并发其他恶性肿瘤者；②患有自身免疫性疾病者；③精神疾病患者。本研究经本院伦理委员会批准，且所有患者知情并签署同意书。

1.3 细胞、主要试剂和仪器人CRC 细胞（SW480、SW620、HT-29 和LoVo）购自中国科学院细胞库，人正常结肠上皮细胞NCM460 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM 和RPMI-1640 培养基（美国Hyclone 公司），胎牛血清（美国Gibco 公司），磷酸盐（phosphate buffer solution，PBS）缓冲液、0.25%胰蛋白酶和DMSO（美国Sigma 公司），MTT 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），TRIzol 试剂（美国Ambion 公司），SYBR FAST qPCR Master Mix（美国KAPA Biosystems 公司），ECL 显影液（美国Millipore 公司），兔抗人B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体、兔抗人Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗体、兔抗人cleaved Caspase-3 抗体和兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（英国Abcam 公司），HRP 标记羊抗兔二抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司），小分子si-PAX8-AS1 和miRNA-22-3p 抑制剂（miR-22-3p inhibitors）均由广州锐博生物科技有限公司合成，双荧光素酶报告基因检测质粒由北京擎科生物技术有限公司合成。倒置显微镜（型号：DMIL LED，德国Leica 公司），酶标仪（型号：AMR-100，杭州奥盛仪器有限公司），流式细胞仪（型号：Accuri C6，美国BD 公司），实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）仪（型号：CFX-Connect 96，美国Bio-Rad公司），全自动化学发光分析仪（型号：Tanon-5200，上海天能科技有限公司）。

1.4 细胞转染和分组取冻存的人CRC 细胞（SW480、SW620、HT-29 和LoVo）和人正常结肠上皮细胞NCM460 复苏后，NCM460 细胞采用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，CRC 细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培养基培养，置于37 ℃、5%CO2的培养箱内，培养2～3 d传代1 次。

取对数生长期SW480 细胞，以每孔1×104个细胞的密度接种于24 孔细胞培养板中。待细胞生长融合至80%时，采用LipofectamineTM2000 转染试剂将si-PAX8-AS1 及其小分子序列阴性对照（siRNA-negative control，si-NC）分别或同时与miR-22-3p inhibitors 及其小分子抑制剂阴性对照（inhibitors negative control，inhibitors NC）转染至细胞中，分为si-NC 组（转染阴性序列）、si-PAX8-AS1 组 （转染 PAX8-AS1 siRNA）、si-PAX8-AS1+inhibitors NC 组（共转染PAX8-AS1 siRNA 和 inhibitors NC）和 si-PAX8-AS1+inhibitors 组（共转染PAX8-AS1 siRNA 和miR-22-3p inhibitors），另取未经任何转染的SW480细胞作为对照组。转染48 h后收集各组细胞沉淀用于后续实验。

1.5 RT-qPCR 法检测CRC 患者癌组织、细胞和各组SW480 细胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p表达水平收集CRC 患者癌组织、癌旁组织及细胞，采用TRIzol 试剂提取癌组织和各组细胞总RNA，逆转录试剂盒将RNA 反转录合成cDNA，以cDNA 为模板，采用RT-qPCR 仪进行PCR 扩增，反应总体积20 μL （SYBR FAST qPCR Master Mix：10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA：1 μL，DNase/RNase-Free water：8 μL），反应条件及过程：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，40 个循环，每个样本设3 个复孔。采用2－ΔΔCt法计算目的基因mRNA 表达水平。引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR

1.6 MTT 法检测各组细胞增殖活性取转染后的各组细胞，以 1×103mL－1的密度接种于96 孔细胞培养板中，分别于培养 24、48 和72 h 后，吸去原培养基，每孔加入20 μL MTT 充分混匀，室温培养4 h，每孔加入 100 μL DMSO混匀，培养15 min，于酶标仪上检测波长490 nm 处吸光度（A）值，以A（490）值代表细胞增殖活性。

1.7 流式细胞术检测各组细胞凋亡率取转染后的各组细胞，以1.5×104mL－1的细胞密度接种于6 孔细胞培养板中，培养24 h 后收集细胞，500 g 离心5 min，弃上清，加入1 mL 预冷PBS 缓冲液重悬，500 g 离心5 min，弃上清，加入500 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，避光条件下加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 混匀，再加入10 μL PI 混匀，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.8 Transwell 小室实验检测各组细胞迁移和侵袭率取转染后的各组细胞，无血清培养液重悬细胞，调整细胞浓度至1.0×105mL－1，取100 μL接种于Transwell 上室，下室加入含血清培养液，培养48 h，弃去培养液，棉签擦去上层细胞，甲醛固定，加入结晶紫染色30 min，漂洗干燥，用棉签小心擦去Transwell 小室中未迁移细胞，置于200 倍显微镜下观察，计数每个视野中迁移细胞数。采用基质胶包被Transwell 上室，其余操作同迁移实验，计数侵袭细胞数，并计算各组细胞迁移和侵袭率。细胞迁移率＝迁移细胞数/接种细胞数×100%；细胞侵袭率＝侵袭细胞数/接种细胞数×100%。

1.9 Western blotting 法检测各组细胞中Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表达水平收集转染后各组细胞，RIPA 裂解液提取细胞全蛋白。采用BCA 法测定蛋白浓度，取25 μg 蛋白配置上样体系，沸水浴变性后采用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，电泳分离后通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，5 %脱脂奶粉于室温条件下封闭2 h，分别加入一抗Bcl-2 （1∶2 000）、Bax （1∶2 000）、cleaved Caspase-3 （1∶1 000）和GAPDH （1∶5 000），于4 ℃孵育过夜。洗膜后，采用HRP 标记的羊抗兔二抗于室温条件下孵育1 h；洗膜后，采用ECL 发光试剂盒A 液和B 液等比混匀，在凝胶成像系统中显影。采用Image J Plus 7.0 分析蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.10 双荧光素酶报告基因实验验证PAX8-AS1 与miR-22-3p 的靶向关系采用生物信息学网站Target San 预测PAX8-AS1 与miR-22-3p 的靶向关系。将PAX8-AS1 野生型（WT）和突变型（MUT）基因靶点荧光素酶表达载体分别与mimics NC 和miR-22-3p mimics 共转染至SW480 细胞中，转染48 h 后采用酶标仪检测萤火虫荧光素酶荧光强度（F）值和海肾荧光素酶荧光强度（R）值，计算各组细胞荧光素酶活性。荧光素酶活性=F 值/R 值。

1.11 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。CRC 组织及癌旁组织中PAX8-AS1 mRNA 和 miR-22-3p 表达水平，各组细胞增殖活性、细胞凋亡率、细胞迁移率和细胞侵袭率，各组细胞中Bcl-2、Bax 和 cleaved Caspase-3 蛋白表达水平和荧光素酶活性均符合正态分布，以±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CRC 组织和细胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表达水平RT-qPCR 结果显示：与癌旁组织比较，CRC 组织中PAX8-AS1 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01），miR-22-3p 表达水平明显降低（P＜0.01）。与NCM460 细胞比较，SW480、SW620、HT-29 和LoVo 细胞中PAX8-AS1 mRNA表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），miR-22-3p 表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中以SW480 细胞中表达水平差异最为明显。见图1 和2。

图1 CRC 患者癌组织和癌旁组织中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表达水平Fig.1 Expression levels of PAX8-AS1H mRNA and miR-22-3p in cancer tissue and adjacent tissue of CRC patients

图2 各种细胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表达水平Fig.2 Expression levels of PAX8-AS1 mRNA and miR-22-3p in different kinds of cells

2.2 各组SW480 细胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表达水平与对照组和si-NC 组比较，si-PAX8-AS1 组细胞中PAX8-AS1 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01），miR-22-3p 表达水平明显升高（P＜0.01）。与si-NC 组比较，si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 组细胞中miR-22-3p 表达水平明显升高（P＜0.01），si-PAX8-AS1+inhibitors 组细胞中miR-22-3p 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 各组SW480 细胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表达水平Fig.3 Expression levels of PAX8-AS1 mRNA and miR-22-3p in SW480 cells in various groups

2.3 不同时间点各组SW480 细胞增殖活性

MTT 法检测结果显示：与对照组比较，si-PAX8-AS1 组、si-PAX8-AS1+inhibitors NC 组和si-PAX8-AS1+inhibitors 组细胞在培养48 和72 h 时细胞增殖活性均明显降低（P＜0.01）。与si-NC 组比较，si-PAX8-AS1 组和si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 组细胞在培养48 和72 h 时细胞增殖活性均明显降低（P＜0.01），si-PAX8-AS1+inhibitors 组细胞在培养24、48 和72 h 时细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 不同时间点各组SW480 细胞增殖活性Fig.4 Proliferation activities of SW480 cells at different time points in various groups

2.4 各组SW480 细胞凋亡率流式细胞术检测结果显示：与对照组比较，si-PAX8-AS1 组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。与si-NC 组比较，si-PAX8-AS1 组和si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。见图5。

图5 各组SW480 细胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups

2.5 各组细胞迁移率和侵袭率Transwell 实验结果显示：与对照组比较，si-PAX8-AS1 组细胞迁移率和侵袭率明显降低（P＜0.01）。与si-NC 组比较，si-PAX8-AS1 组和si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 组细胞迁移率和侵袭率明显降低（P＜0.01），si-PAX8-AS1+inhibitors 组细胞迁移率和侵袭率差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

图6 各组细胞侵袭和迁移率Fig.6 Migration and invasion rates of cells in various groups

2.6 各组SW480 细胞中Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表达水平Western blotting 法检测结果显示：与对照组和si-NC 组比较，si-PAX8-AS1 组SW480 细胞中Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图7。

图7 各组SW480 细胞中Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.7 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of Bcl-2, Bax and cleaved Caspase-3 proteins in SW480 cells in various groups

2.7 PAX8-AS1 和miR22-3p 的靶向关系和各组细胞中荧光素酶活性生物信息学网站TargetScan 预测显示：PAX8-AS1 与miR22-3p 存在靶向结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示：与共转染mimics NC 的细胞比较，共转染miR-22-3p mimics的PAX8-AS1-WT 细胞中荧光素酶活性明显降低（P＜0.01），而共转染miR-22-3p mimics PAX8-AS1- MUT 细胞中荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。见图8。

图8 各组细胞中荧光素酶活性Fig.8 Lucriferase activities of cells in various groups

3 讨 论

CRC 是全球最常见的癌症之一，由于其在全球范围内的高发病率和高死亡率，CRC 已成为全球公共卫生问题［9］。寻找CRC 特异性肿瘤标志物和治疗靶点对于 CRC 早期检测和预后预测的准确性具有重要意义。

由于高通量基因组测序工具的发展，发现新的 lncRNAs 通常与癌症有关，特别是与 CRC 有关。在生理条件下，lncRNA 调节基因表达、表观遗传印记或可变剪接，充当原癌基因或肿瘤抑制基因［10］。研究［11］表明：lncRNA 与人类疾病密切相关。作为癌基因或抑癌基因，lncRNA 表达失调与癌症的进展密切相关，其可以调节上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、细胞转移、凋亡、迁移和侵袭［12-16］。本研究结果显示：PAX8-AS1 在 CRC 组织和细胞中高表达。si-PAX8-AS1 转染的CRC 细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制，凋亡增加。表明PAX8-AS1 在CRC 中作为癌基因影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。

研究［17-18］表明：miR-22-3p 作为抑癌基因，在CRC 组织中明显下调，并在体外抑制 CRC 细胞增殖、集落形成、细胞迁移和侵袭能力，在体内抑制 CRC 异种移植肿瘤的生长。本研究结果显示：miR-22-3p 在 CRC 组织和细胞中低表达，与PAX8-AS1 基因高表达呈负相关关系。通过抑制PAX8-AS1 基因的表达，抑制了CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且促进了miR-22-3p 表达水平。提示PAX8-AS1 与miR-22-3p 可能存在靶向调控关系。

研究［19］表明：lncRNA 通过海绵化miRNAs参与内源竞争RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）。lncRNA HULC 过表达通过海绵化miR-372 促进肝癌的发展和癌细胞侵袭［20］。此外，lncRNA RP4 充当miR-7-5p 的ceRNA 以调控CRC进展［21］。本研究通过生物信息学分析发现PAX8-AS1 可能靶向miR-22-3p。通过荧光素酶报告基因实验验证PAX8-AS1 与miR-22-3p 之间的直接相互作用。抑制PAX8-AS1 表达能够促进 miR-22-3p 表达上调，并进一步抑制CRC 细胞增殖、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡。

综上所述，PAX8-AS1 通过海绵化吸附 miR-22-3p 对CRC 细胞增殖、凋亡及侵袭产生影响，调控CRC 进展。本研究结果为PAX8-AS1 作为CRC的治疗靶点提供了新的理论依据。