PCSK9对血管内皮功能影响的研究进展

许晓宇 唐炯 郑甲林

(昆明医科大学附属心血管病医院(云南省阜外心血管病医院),云南 昆明 650000)

血管内皮是血管系统重要的组成部分之一,与血管扩张功能、血管屏障功能和抗炎作用相关。血管内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化过程中的诱发因素,进而导致动脉粥样硬化性心血管疾病[1]。动脉粥样硬化斑块的形成浆是由慢性炎症引起的,包括内皮功能紊乱和血浆胆固醇水平升高[2]。血浆中低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平升高,可以促进内皮功能紊乱。前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)在脂蛋白代谢中起着关键作用。它是成人心血管疾病的靶向生物标志物[3]。用抗PCSK9抗体依洛尤单抗和阿利西尤单抗进行被动免疫已被证明能有效地降低低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)水平和减少心血管疾病[4]。现将PCSK9对血管内皮功能的影响综述如下。

1 PCSK9的基因表达

PCSK9是一种主要由肝脏产生的丝氨酸蛋白酶,在肝脏分泌后,PCSK9与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)结合,通过直接进入溶酶体诱导其降解。PCSK9通过促进肝细胞内LDLR的降解,在调节血浆LDL-C浓度方面起着重要作用[5]。人PCSK9的基因位于染色体1p32[6],有12个外显子和11个内含子,编码692个氨基酸的蛋白酶,由4个结构域组成,即N端结构域、信号肽、催化结构域和C端结构域,在内质网中形成,相对分子质量为1.2×105[6-7]。由于PCSK9诱导LDLR的降解,使用药物抑制这一降解,将延长LDLR的作用时间,使LDL-C水平急剧降低[8]。PCSK9还通过增强LDLR的内吞作用和阻止其循环来降解LDLR[9]。C末端半胱氨酸、富含组氨酸的结构域(Cys-His-rich domain,CHRD)在PCSK9诱导的LDLR降解过程中发挥关键作用[10]。具体来说,PCSK9的C末端CHRD与LDLR中的表皮生长因子前体同源结构域相互作用,参与LDLR的细胞内降解,减少细胞表面的LDLR数量,减少LDL-C的清除,从而使血浆中LDL-C增加[11]。PCSK9的表达也受空腹和胰岛素水平的影响,通过胆固醇调节元件结合蛋白-1c途径[5]。最近PCSK9作为高胆固醇血症患者LDL水平降低的靶点受到广泛关注[4]。

2 PCSK9在细胞和组织中的表达

PCSK9属于前蛋白转化酶家族,主要在肝脏表达,是循环PCSK9的主要来源[12]。PCSK9在结肠、回肠、胰腺β细胞、十二指肠、肾脏、大脑、缺血性心脏中高表达以及血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞中也有高表达,血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞直接参与各种血管疾病的发生和发展[5,12]。特别是在炎症条件下,平滑肌细胞和巨噬细胞会分泌大量的PCSK9[13]。

PCSK9在内皮细胞中表达,直接调节内皮细胞中LDLR的表达[14]。内皮细胞和血管平滑肌细胞在低血流条件下显示出比高血流条件下更高的PCSK9蛋白表达,此外这种效应在脂多糖的刺激下会增强[13]。

血管平滑肌细胞中PCSK9的高表达受内毒素、肿瘤坏死因子-α、活性氧和受损线粒体DNA的调节[15]。平滑肌细胞移入内膜和细胞外基质的沉积有助于形成纤维帽,将斑块的脂质核心与流动的血液分开[16]。一项研究[17]发现,PCSK9在平滑肌细胞增殖中的作用可能在于激活哺乳动物雷帕霉素靶点,磷酸化的雷帕霉素靶蛋白是一种参与细胞生长、存活和增殖的激酶。胰岛素可通过激活哺乳动物雷帕霉素途径的靶点导致肝细胞核因子-1α的核扩散,减少PCSK9的表达。相反,胰岛素抵抗会导致肝细胞核因子-1α分泌不足,从而促进PCSK9的过度分泌[18]。

PCSK9诱导促炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素(interleukin,IL)-6,还促进致炎转录因子的核定位,并抑制巨噬细胞中抗炎细胞因子的产生[2]。PCSK9和巨噬细胞中的促炎细胞因子之间存在双向互动,PCSK9参与细胞因子的合成,同时也促进炎症的发生。已有研究表明,脂多糖、氧化型LDL、IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α和γ干扰素调节巨噬细胞中PCSK9的表达和分泌[19]。

PCSK9也在人类胰腺β细胞表达、合成和分泌[20]。PCSK9基因的表达被转录因子肝细胞核因子-1α诱导,后者是胰岛素基因的重要激活剂[20]。以前的研究[21]表明,2型糖尿病患者的PCSK9水平升高,PCSK9水平与LDL、空腹血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗呈正比。有研究[22]发现,在女性糖尿病前期受试者中,循环PCSK9水平与2型糖尿病发病风险之间呈正比。可见PCSK9在糖尿病的发展中起着关键作用。

3 PCSK9参与血管内皮功能障碍可能的机制

动脉粥样硬化是由血管内皮功能的改变引发,与LDL-C在动脉壁内层的积聚、氧化和糖化,黏附分子的表达和趋化物质的释放有关[7]。PCSK9可能直接或间接地促进动脉粥样硬化的进展,并导致内皮功能障碍[23]。内皮功能障碍被定义为内皮来源一氧化氮的产生或生物利用的不平衡,导致血管舒张反应减弱,形成血栓前状态和炎症内皮细胞[24]。正常的冠状动脉内皮功能主要由内皮释放的一氧化氮介导,可以通过测量冠状动脉横截面面积和冠状动脉血流对内皮刺激的反应来评估。冠状动脉内皮功能障碍是导致动脉粥样硬化性心血管疾病的重要原因[25]。PCSK9不仅可能影响血脂,还可能与心血管危险因素如胰岛素抵抗、炎症、血小板激活和血栓形成相关(图 1)[26]。PCSK9对血脂和动脉粥样硬化的影响涉及调节LDL-C清除以外的机制[8]。除了已知的肝脏LDLR介导的影响外,PCSK9也与血管炎症有关[16]。PCSK9是一个重要的组成分子,与动脉粥样硬化过程中的其他关键因素相互作用,如凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)[27]。PCSK9促进炎性细胞因子的产生,并促进氧化应激和动脉粥样硬化的发展[28]。冠状动脉内皮功能异常是血管健康程度降低的一个指标。PCSK9对氧化还原系统和血小板激活有调节作用,特别是,PCSK9在激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2系统、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联通路以及CD36和LOX-1下游途径中起作用[29]。

注:TLR4,Toll样受体4;MyD88,髓样分化因子88;NF-κB,核因子-κB;Bcl-2,B细胞淋巴瘤因子-2;JNK,c-Jun氨基端激酶。

3.1 肝脏LDLR的溶酶体降解

PCSK9通过促进肝脏LDLR的溶酶体降解,减少血浆中LDL的清除[30],还能促进LDL的氧化,以诱导内皮细胞的凋亡,导致人体的内皮功能紊乱[31]。脂质代谢紊乱、内皮功能障碍在动脉粥样硬化过程中起着关键作用[8]。血浆中的PCSK9以及血管平滑肌细胞和巨噬细胞可能参与动脉粥样硬化斑块的形成。循环中胆固醇水平升高可能与内皮功能受损有关[32]。PCSK9抑制剂是一种新型的降脂药。它已被证明是控制血脂的有效新疗法,特别是在使用最大耐受剂量的他汀类药物与依折麦布联合治疗后仍不能充分降脂的患者。低PCSK9水平通过减少肝脏中LDLR的降解而降低LDL-C水平,这有助于预防心血管疾病[26]。

3.2 内皮细胞细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1表达的增加

内皮功能障碍也会导致炎性蛋白的分泌[3]。血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)是一种在炎症条件下表达增加的蛋白,介导淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞对血管壁的黏附。PCSK9诱导血管平滑肌细胞表达VCAM-1,抑制PCSK9可明显减少VCAM-1的表达[33]。PCSK9已被证明通过上调内皮细胞细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和VCAM-1的表达而参与内皮功能障碍,ICAM-1水平与PCSK9表达水平直接相关[34]。在动脉粥样硬化性血管损伤的基本步骤中,LDL刺激内皮细胞表面ICAM-1和VCAM-1的表达,进而促进循环中炎性白细胞的黏附[34]。

3.3 血小板的激活和血栓

PCSK9参与血小板的激活[11],它通过促进血小板的活化和白细胞的募集来调节血栓形成[4]。PCSK9通过与CD36结合并激活CD36依赖的信号通路而作用于血小板活化。通过与CD36结合,从而激活Src激酶、MAPK-胞外信号调节激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK),增加活性氧的生成,并激活CD36下游的p38MAPK/胞浆型磷脂酶A2/环氧合酶-1/血栓素A2信号通路,增强血小板活化[35]。血小板不仅在血栓生长中起作用,而且在刺激下诱导LDL氧化,促进动脉粥样硬化[29]。血小板还受到氧化型LDL的影响,这与PCSK9间接相关。氧化型LDL刺激血小板上的LOX-1,支持PCSK9/CD36依赖的p38MAPK的激活和血小板的激活[36]。在心房颤动患者的血液循环中,PCSK9可以通过增强NADPH氧化酶2的活性直接引发CD36介导的血小板激活[37]。总之,PCSK9通过与CD36结合促进血小板的活化和血栓形成。

3.4 炎症和Toll样受体4/髓样分化因子88/核因子-κB信号通路

炎症是脂质和内皮之间关系的一个重要因素。脂质代谢异常导致内皮损伤和动脉粥样硬化形成[25]。炎症激活和内皮功能紊乱参与了动脉粥样硬化的发展,并与心血管事件的风险增加有关[24]。炎症过程在LDL通过内皮细胞的运输和LDL在动脉壁的滞留中起作用[38]。PCSK9水平升高也会刺激促炎细胞因子的分泌,激活巨噬细胞中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号的募集[6]。血管平滑肌细胞释放的PCSK9可影响巨噬细胞表面LDLR的表达,PCSK9还可促进巨噬细胞的炎症反应[8]。在炎症环境中,PCSK9的高表达会刺激巨噬细胞表达LOX-1和氧化型LDL摄取,此外,PCSK9可能通过调节动脉壁中的促炎单核细胞直接促进动脉粥样硬化[8]。PCSK9诱导的炎症反应可能与PCSK9激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NF-κB通路有关,脂多糖被认为是通过刺激TLR4/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/NF-κB信号通路成为PCSK9的有力诱导剂[13]。TLR4是一种参与局部或全身免疫反应的跨膜受体,导致与多种炎性细胞因子相关的转录因子NF-κB的激活和核转位[39]。不同的血流类型已被证明在炎症环境下通过TLR4/MyD88/NF-κB促炎细胞因子信号通路调节PCSK9的表达,异常血流动力和促炎细胞因子是PCSK9分泌的关键调节因子[13]。PCSK9与血管内皮功能和平滑肌炎症反应之间的联系是由PCSK9激活NF-κB介导的[40]。冠状动脉内皮功能障碍和血管炎症与PCSK9水平的升高有关,NF-κB信号通路在PCSK9介导的血管炎症中起关键作用[41]。研究[42]表明,在小鼠败血症模型中PCSK9可以通过激活TLR4/MyD88/NF-κB和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)途径增加炎症细胞因子的产生,进而损害血管内皮细胞功能,降低内皮依赖性血管扩张和屏障功能。总的来说,PCSK9可以与TLR4结合,调节炎症因子的表达,影响炎症性疾病的进程。

3.5 Bcl-2/Bax-caspase9-caspase3线粒体通路和p38/JNK/MAPK信号通路

内皮细胞凋亡改变内皮细胞完整性,促进内皮细胞功能障碍和动脉粥样硬化的形成。Bax是一种促凋亡蛋白,可以通过在线粒体外膜上形成孔洞来改善膜的透过性。而Bcl-2的作用正好相反,是一种抗凋亡蛋白。Bcl-2/Bax的比值反映了细胞发生凋亡的能力[43]。在血管内皮细胞壁表达的PCSK9已被证明通过Bcl-2/Bax-caspase9-caspase3线粒体通路和p38/JNK/MAPK信号通路促进炎症和内皮细胞凋亡,破坏内皮的完整性,导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化的发展[43]。一项对人脐带血内皮细胞的试验[44]表明,PCSK9通过Bcl-2/Bax-caspase9-caspase3途径参与氧化型LDL诱导的细胞凋亡。

3.6 胰岛素抵抗和糖尿病

除了PCSK9水平升高外,心血管疾病风险的增加也可能是胰岛素抵抗和糖尿病发病率增加的结果[45]。2型糖尿病会导致严重的微血管和大血管并发症,可导致患者死亡[23]。血管内皮功能障碍在糖尿病患者中很常见,并因缺血再灌注损伤而加重。其机制可能与内皮细胞的收缩和舒张因素之间的不平衡有关,如一氧化氮和内皮素-1[46]。在一项研究中,发现血浆PCSK9水平与血管反应指数(微血管功能)相关,但与脉搏波传导速度(动脉僵硬度)无关。这可能表明糖尿病血管内皮功能障碍的早期症状发生在微血管系统,而不是在大动脉[23]。综上所述,PCSK9水平升高与血管内皮功能障碍有一定关系。

4 PCSK9抑制剂的药理

PCSK9可以减少肝细胞表面的LDLR数量,导致血浆中胆固醇水平升高[9]。PCSK9抑制剂依洛尤单抗是一类新的降脂药物,适用于他汀类药物和依折麦布的联合治疗,以及他汀类药物和/或依折麦布耐受性和心血管风险增加的患者的单一治疗[47]。PCSK9抑制剂可以抑制PCSK9与LDLR的结合,其作用于PCSK9蛋白本身,而不是作用于基因表达。目前使用的阻断PCSK9和LDLR之间相互作用的抑制剂有阿利西尤单抗和依洛尤单抗[6]。使用依洛尤单抗140 mg治疗2个月,可改善心血管风险增加者的内皮功能。内皮功能的改善与LDL水平的降低密切相关[32]。用PCSK9抑制剂治疗后,观察到内皮功能的改善,而无副作用。这表现在血流介导的血管舒张功能和速度时间积分值的增加,以及LDL-C水平的明显下降[32]。PCSK9抑制剂已被证明在单独使用时可降低LDL水平50%,与他汀类药物联合使用时可降低LDL水平70%[48]。

5 PCSK9抑制剂与冠状动脉内皮功能

高血压、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖、不健康饮食和运动不足是与动脉粥样硬化相关的心血管疾病的重要危险因素[11]。PCSK9抑制剂可逆转动脉粥样硬化斑块,缩小心肌梗死面积,改善血管钙化[12]。抗PCSK9单抗治疗也能改善急性冠脉综合征患者的心血管预后,这可能是由于PCSK9对内皮功能、斑块稳定和血小板激活的直接影响受到抑制,也可能是由于对脂质平衡的影响间接导致[49]。

用PCSK9抑制剂依洛尤单抗抑制PCSK9,可迅速逆转HIV感染者和血脂异常患者的冠状动脉内皮细胞功能障碍[25]。一项研究[40]表明,冠状动脉内皮功能异常与血清PCSK9水平升高显著相关,表明抑制PCSK9可改善受损的冠状动脉内皮功能。用依洛尤单抗治疗2个月后,内皮功能的改善与LDL-C水平的下降成正比[32]。在急性冠脉综合征的早期阶段抑制PCSK9有潜在的好处,特别是对于合并高PCSK9水平的糖尿病患者,这是通过降低血脂和炎症/血小板途径的双重机制实现的[50]。PCSK9抑制剂对冠状动脉疾病患者血管内皮祖细胞生物学有良好的效果,接受PCSK9抑制剂治疗的患者血管内皮祖细胞计数和增殖能力明显增加,这也与血管内皮生长因子水平的升高有关[27]。对PCSK9基因敲除小鼠的体内研究[51]表明,PCSK9的基因敲除导致低胆固醇血症,明显延缓动脉粥样硬化的发展,增加对他汀类药物的敏感性,使PCSK9成为降低LDL治疗的靶点。用依洛尤单抗抑制PCSK9,使异常的冠状动脉内皮功能得到明显改善[25],抑制PCSK9对冠状动脉内皮功能的影响迅速,仅1周后就有改善的趋势,6周后冠状动脉内皮功能得到明显改善[25]。如上所述,PCSK9抑制剂能有效降低血脂水平、改善血管内皮功能、抑制炎症反应,相关药物的开发对治疗心血管疾病很重要。

6 小结和展望

PCSK9是一种蛋白酶,主要由肝细胞产生和释放。它通过与LDLR结合并导致其在细胞内溶酶体降解而起作用。毫无疑问,动脉粥样硬化的发展与血浆中LDL水平有关。抑制PCSK9所致的LDL水平降低可能是抑制动脉粥样硬化的一个潜在机制。然而,PCSK9抑制剂改善心血管预后的机制仍未完全阐明。除降低血浆LDL水平外,其他效应也可能起作用。在治疗方面,PCSK9抗体可抑制LDLR的表皮生长因子前体同源结构域与PCSK9之间的相互作用,以降低血浆LDL-C水平,并已安全用于临床。靶向PCSK9治疗可能对未来心血管疾病的治疗有重要的临床意义,有望给患者带来更多临床效益。