质谱分析联合网络药理学探析固本方对三阴性乳腺癌的作用机制

杨丽娜， 杨振江， 古宏晖， 陈钟， 何力

（深圳市中医院肿瘤与血液病科，广东深圳 518033）

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指病理表现为雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER2）均阴性的一种特殊类型乳腺癌，占女性乳腺癌15%左右，与其他类型乳腺癌5年生存率相差12%～20%，预后差的主要原因为容易复发转移、且一旦复发转移后缺乏有效治疗[1]。早期降低复发转移是改善TNBC 不良预后的重要手段，除了通过新辅助化疗、免疫治疗提高病理完全缓解（pathological complete response，PCR）率，以及辅助化疗方案优化，术后综合治疗后的维持治疗也是一种重要手段。口服甲氨喋呤、环磷酰胺、卡培他滨等药物被用于Ⅱ～Ⅲ期TNBC 综合治疗后的维持治疗，可延长术后2 ～3 年无病生存期（disease-free survival，DFS）、减少复发转移率。尽管这些口服化疗药物服用简便、费用相对低廉，但长期服用存在化疗毒副作用，限制临床应用，目前TNBC 术后仍缺乏有效的维持治疗方法[2-4]。而中医药治疗TNBC 显示出了一定的优势，有研究[5-6]表明，联合或者不联合西医放化疗，中成药或辨证中药内服作为TNBC 术后维持治疗手段，不仅可改善患者症状、提高卡氏评分（Karnofsky performance status，KPS）、改善生活质量，还可以降低复发转移率、延长DFS（率）、提高生存率，且无长期口服化疗药物维持治疗的毒副作用累积，如手足综合征、骨髓抑制等，是一种可行的选择。固本方为科室经验方，基于文献研究、名老中医经验及临床经验组方而成，全方扶正抗癌、调和气机，临床观察可改善患者生活质量、延长DFS期[7]。本研究运用质谱联合网络药理学分析固本方抗TNBC 的靶点及通路，并进行实验验证，以探索固本方治疗TNBC 的作用机制[7]，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 质谱分析

1.1.1 质谱条件 岛津LCMS-2020型质谱仪；色谱柱：Thermo AcclaimTM120 色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。以乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，梯度洗脱：0 ～10 min，20% ～45%乙腈；10 ～25 min，45% ～67%乙腈；25 ～30 min，67% ～90%乙腈；30 ～42 min，90%乙腈；42 ～44 min，90% ～20%乙腈；44 ～54 min，20%乙腈。柱温：30 ℃。体积流量：0.8 mL/min。

采用电喷雾离子化源（ESI）；载气为N2，体积流量1.5 L/min；离子喷雾温度为350 ℃。同时检测正负离子模式，扫描方式为选择离子检测模式（SIM）；用于定量分析检测的离子为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷m/z447.10[M+H]+；贝母素甲m/z432.30[M+H]+；澳洲茄碱m/z884.40[M+H]+；党参炔苷m/z419.20[M+H]+；芒柄花苷m/z431.10[M+H]+；毛蕊异黄酮m/z285.05[M+H]+；芒柄花素m/z269.05[M+H]+；紫杉醇m/z854.30[M+H]+；灵芝酸Bm/z515.20[M+H]-；柴胡皂苷Am/z779.35[M+H]-；齐墩果酸m/z455.25[M+H]-；熊果酸m/z455.25[M+H]-。

1.1.2 固本方冻干粉制备 固本方中药组成：党参30 g、黄芪20 g、灵芝30 g、白术10 g、山药15 g、枸杞子15 g、薏苡仁30 g、浙贝母15 g、柴胡10 g、郁金10 g、红豆杉6 g、龙葵15 g、白花蛇舌草20 g。中药材来源于深圳市中医院中药房。每剂制成400 mL 水煎剂，共3 剂，由深圳市中医院中药房提供。将药液1 200 mL 使用滤纸过滤，收集滤液，使用高速离心机10 000 r/min（离心半径4 cm）4 ℃离心15 min 进一步去除杂质，收集离心后的滤液，旋转蒸发仪60 ℃旋转浓缩至200 mL，置于真空冻干装置中冻干，制备冻干粉。取固本方冻干粉1 g，精密称定，加75%甲醇20 mL，称定质量，再超声30 min，放冷，用75%甲醇补足质量。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 固本方潜在作用靶点收集 运用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得固本方化学成分的SMILE 结构， SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测靶点，去除重复值，利用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）标准化靶点名称。

1.2.2 TNBC 靶点检索 以“triple-negative breast cancer”检索以下数据库：TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）、OMIM（https://omim.org/）、KEGG（http://www.kegg.jp/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）、GeneCard（https://www.genecards.org/）；以“basal-like breast carcinoma/triple-negative breast neoplasms” 检索DisGeNET 数据库（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）。汇总数据库、去除重复项后得到TNBC疾病靶点。

1.2.3 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析 运用Venny 2.1 数据库（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到固本方与TNBC 交集的靶点，利用STRING 数据库（https://string-db.org/）构建交集靶点的PPI 网络，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，“minimum required interaction score”设为0.90，Cytoscape NetworkAnalyzer插件展示PPI 网络，用R 包（http://www.r-project.org/，version 3.6.0）计算基因频数并绘制基于PPI的条形图。

1.2.4 生物功能和通路分析 应用DAVID 工具（https://david.ncifcrf.gov/）对固本方治疗TNBC 的靶点进行KEGG 富集分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.3 体外实验

1.3.1 细胞株 人乳腺癌MDA-MB-231，购自上海细胞库（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。

1.3.2 试剂与仪器 DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）检测试剂盒（上海碧云天试剂公司）；兔抗蛋白激酶B（Akt）抗体、兔抗磷酸化Akt（p-Akt）抗体、兔抗磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶（p-PI3K）抗体、兔抗GAPDH 抗体、羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）偶联IgG 二抗（美国Santa Cruz 公司）。低速离心机（江苏金坛荣华仪器有限公司）；水平离心机（长沙湘智离心机有限公司）；冻干机（杭州东芝公司）；Western Blot电泳仪（上海博能公司）。

1.3.3 药物制备 固本方溶液制备：称取32 mg固本方冻干粉，加入DMEM 培养基100 mL，充分震荡并超声助溶，以6 000 r/min（离心半径4 cm）离心10 min 后取上清，0.22 μm 滤器过滤，制备成320 μg/mL 的母液，4 ℃冰箱保存。卡培他滨片（瑞士Roche Laboratories 公司生产，批号：国药准字J20030108）溶液制备：按文献研究[8]方法，将卡培他滨500 mg/片研磨后用1 000 mL PBS 溶解，用DMEM培养基稀释为1 μg/mL溶液。

1.3.4 观察指标与方法

1.3.4.1 MTT法检测MDA-MB-231细胞活力 按说明书操作。以固本方不同浓度（20、40、80、160、320 μg/mL）分别处理细胞，分别培养24、48、72、96 h，空白对照组用等体积磷酸盐缓冲液（PBS）处理。根据MTT实验结果，分别使用48 h组的IC50的25%、15%、10%（132、79、 53 μg/mL）作为固本方高、中、低剂量。

1.3.4.2 Western Blot 法检测MDA-MB-231 细胞Akt、p-Akt、p-PI3K 蛋白表达 将实验共分为5 组：空白对照组，卡培他滨组（1 μg/mL）及固本方高、中、低剂量组。处理48 h 后收集各组细胞蛋白质样本，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度后分装， 每个泳道上蛋白样品30 μg。采用Bio-Rad标准湿式转膜装置，用聚偏氟乙烯（PVDF）膜，电流为300 mA，时间为90 min。使用封闭液稀释一抗抗体（1∶1 000）、GAPDH 抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜。加入HRP 偶联的IgG 二抗（1∶5 000）后摇床摇动室温孵育1 h。TBST 洗膜。显色，成像。以GAPDH 为内参对照，计算各个样本目的蛋白条带与GAPDH 条带的灰度比值，作为目的蛋白的相对表达水平，应用Gel-Pro analyzer 4.0软件进行数据分析。

1.3.5 统计方法 Graphpad Prism 7.0 软件作图。采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析。计量资料满足正态分布及方差齐性时，以均数± 标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步采用LSD 法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 固本方质谱分析基于ESI-LC-MS/MS 条件对固本方成分进行检测，得到固本方正离子模式、负离子模式总离子流图，见图1 ～图2。测定固本方化学成分含量，列出其来源中药，见表1。固本方主要化学成分为：党参炔苷、灵芝酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、柴胡皂苷A、芒柄花苷、澳洲茄碱、贝母素甲、毛蕊异黄酮、熊果酸、齐墩果酸、芒柄花素、紫杉醇。

表1 固本方化学成分含量Table 1 Chemical composition content of Guben Prescription

图1 固本方正离子模式总离子流图Figure 1 Total ion flow diagram for positive ion mode of the Guben Prescription

图2 固本方负离子模式总离子流图Figure 2 Total ion flow diagram for negative ion mode of the Guben Prescription

2.2 固本方化学成分-TNBC交集靶点运用TCMSP、PubChem 数据库获得固本方12 种化学成分的SMILE结构，SwissTargetPrediction 数据库预测其作用靶点，共获得1 231 个靶点，去除重复值后获得575个靶点。去除重复项、标准化后共收集到TNBC靶点2 256个。

运用Venny 2.1 数据库绘制维恩图，得到236 个固本方与TNBC 交集的靶点，绘制交集靶点的PPI 网络图，前30 位靶点见图3。丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、sarcoma 基因（SRC）、磷脂肌醇3-激酶相关基因（PIK3CA、PIK3R1）、Akt1、信号传导与转录激活因子3（STAT3）等为固本方治疗TNBC 的潜在核心靶点。

图3 固本方治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的核心靶点Figure 3 Core targets of Guben Prescription in the treatment of triple-negative breast cancer（TNBC）

2.3 固本方治疗TNBC的基因功能和通路富集分析KEGG 富集通路共得到161 条通路，图4 显示据基因数值（count）排序富集显著的前20 条通路，其中，PI3K/Akt信号通路富集结果显著且靶点数最多，提示固本方治疗TNBC 中PI3K/Akt信号通路可能发挥重要作用。

图4 固本方治疗三阴性乳腺癌（TNBC）KEGG通路富集分析Figure 4 Enrichment analysis of KEGG pathway in triple-negative breast cancer（TNBC）treated with Guben Prescription

2.4MTT法测定固本方对MDA-MB-231细胞增殖的影响随着作用时间的延长，不同浓度固本方的细胞增殖抑制率呈递增趋势，于96 h，各浓度固本方组的细胞增殖抑制率与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.001），见图5-A；随着给药浓度的增加，固本方作用不同时间后的细胞增殖抑制率递增，固本方浓度为320 μg·mL-1时，72 h组和96 h 组的细胞增殖抑制率与24 h 组比较，差异有统计学意义（P＜0.001），见图5-B。

图5 不同浓度固本方对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响Figure 5 The effect of different concentrations of Guben Prescription on the proliferative capacity of MDA-MB-231 cells

结果表明，固本方对细胞增殖的抑制时间从48 h开始趋于明显，因此，选择48 h时间点进行进一步研究，故以48 h 组IC50的25%、15%、10%（132、79、53 μg/mL）作为固本方高、中、低剂量组用药浓度。

2.5 固本方对Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表达的影响网络药理学分析结果提示，固本方通过PI3K/Akt通路发挥作用。为验证该结果，本实验采用Western Blot 法检测固本方作用乳腺癌细胞MDA-MB-231 后PI3K/Akt 通路中Akt、p-Akt、p-PI3K 的蛋白表达情况。图6、表2 结果显示，与空白对照组比较，固本方各剂量组、卡培他滨组细胞Akt、p-Akt、p-PI3K 表达蛋白水平下降（P＜0.001）；与卡培他滨组比较，固本方各剂量组细胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表达水平升高（P＜0.001）。

表2 固本方对MDA-MB-231细胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表达水平的影响Table 2 Effects of Guben Prescription on the protein expression levels of Akt，p-Akt and p-PI3K in MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

表2 固本方对MDA-MB-231细胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表达水平的影响Table 2 Effects of Guben Prescription on the protein expression levels of Akt，p-Akt and p-PI3K in MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

注：①P＜0.001，与空白对照组比较；②P＜0.001，与卡培他滨组比较

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图6 固本方对MDA-MB-231细胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表达的影响Figure 6 Effect of Guben Prescription on Akt，p-Akt and p-PI3K protein expression in MDA-MB-231 cells

3 讨论

三阴性乳腺癌（TNBC）患者术后易早期复发转移，具有不同于其他类型乳腺癌的特点，归属于中医学“乳岩”的范畴。TNBC 患者以绝经前年轻女性居多，存在气机郁滞、肝郁痰凝的病机[9]。气机郁滞致气机升降失常，气血津液运行不畅，内生痰瘀，积而成块。纵观文献研究[10-17]所示，中医对TNBC 术后、放化疗后病机的认识以正虚邪实为主。手术、放化疗损伤致脏腑亏虚、机体气机升降失调，癌毒易停留郁结于体内，在脏气失摄的情况下则可流窜停留于他脏导致邪毒内停，易致复发转移。名老中医张代钊、郁仁存治疗乳腺癌常用龙葵、白花蛇舌草清热解毒，浙贝母化痰散结；朴炳奎教授治疗乳腺癌常用薏苡仁祛湿化痰，白花蛇舌草清热解毒抗癌；孙桂芝教授常用浙贝母软坚散结，白花蛇舌草抗癌。本课题组还总结了深圳市名中医欧阳郴生教授治疗乳腺癌的用药规律，其认为肝脾失和、气机升降失常为乳腺癌发病之本，以疏肝健脾、调和气机为主要治则，常选用柴胡、郁金药对调节气机升降，并指出TNBC 患者术后易复发转移与气机升降失常、正虚邪毒内停有关，治疗中除了扶正抗癌外，还应重视调和气机、调畅情志[18-19]。固本方正是基于文献研究、名老中医经验及临床经验成方，以扶正抗癌、调和气机为基本治则，用于TNBC 术后、放化疗后预防复发转移。方中：党参、黄芪为君药以健脾益气；臣药以灵芝补气安神，白术健脾益气、燥湿利水，山药健脾补肾，枸杞子滋补肝肾；佐药以薏苡仁健脾渗湿，浙贝母化痰散结，红豆杉散结抗癌，龙葵、白花蛇舌草清热解毒；使药以柴胡、郁金疏肝行气、调和气机。全方扶正与祛邪兼顾，重视气机升降失调病机、调和气机治法。临床观察固本方可改善患者生活质量，延长DFS。部分现代药理学研究亦显示，黄芪、党参、山药、龙葵可增强免疫、抗肿瘤、抑制TNBC 细胞增殖、诱导凋亡[20-22]。

PPI 网络显示，磷脂肌醇3-激酶相关基因（PIK3CA、PIK3R1）、Akt1 等为固本方治疗TNBC的潜在核心靶点，PI3K/Akt 信号通路发挥主要作用。PI3K/Akt 通路是TNBC 疾病进程中的重要通路[23]。早期乳腺癌及转移性乳腺癌常见PIK3CA 激活突变、抑癌基因PIK3R1 失活，PIK3CA 突变与化疗耐药及不良预后相关。PIK3CA 抑制剂正在进行实验及临床研究，与CDK4/6 抑制剂、抗Her-2治疗、免疫治疗、PARPi联合或许可获得更好的疗效[24]。TNBC 中Akt1 表达高于癌旁组织，Akt1 与TNBC 发生、发展和转移密切相关[25]。敲减Akt1后，乳腺癌MDA-MB-231 细胞的迁移能力明显增强，Akt1对乳腺癌细胞迁移起负性调控作用[26]。

本研究结果显示，固本方呈时间和浓度依赖性抑制MDA-MB-231 细胞增殖。经质谱分析获得固本方化学成分后进一步网络药理学分析显示，PI3K/Akt 信号通路在固本方治疗TNBC 中发挥主要作用，细胞实验结果显示：固本方可下调乳腺癌细胞MDA-MB-231 中Akt、p-Akt、p-PI3K 的蛋白表达。表明Akt和PI3K 为固本方治疗TNBC 的关键靶点。

综上所述，在临床疗效基础上，本次细胞实验结果验证了固本方对TNBC 细胞系的抑制作用，并论证了网络药理学的结果，后续拟以PI3K/Akt通路为靶点开展进一步研究。由于经费限制，本研究仅用1种细胞株，未进行动物实验验证，未进行固本方与卡培他滨联合用药的研究，未进行过表达或沉默（rescure）操作，对机制的阐明有待深入加强，下一步可开展多细胞株平行验证，并拟通过临床扩大样本研究观察固本方临床疗效及不良反应。