民族药锅铲藤的质量标准研究

赫伟 周成蕾 杨信 李丽 汤果怡

【摘 要】 目的：建立锅铲藤药材的质量标准。方法：对锅铲藤基原植物的藤茎及叶进行性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别，测定锅铲藤的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、重金属、农药残留。结果：确定了锅铲藤的基原植物为镰葉西番莲Passiflora wilsonii Hemsl.。明确了锅铲藤基原植物的藤茎和叶横切面的组织构造特征及粉末鉴别特征，初步建立了锅铲藤的薄层色谱鉴别方法。确定了锅铲藤质量标准规定。结论：文章建立的方法可作为评价锅铲藤质量的标准。

【关键词】民族药；质量标准；镰叶西番莲；显微鉴别；肝炎

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）11-0029-06

Abstract：Objective To establish the quality of etnnicemedicine Caulis Passifrorae.Methods Todetermine the original plants of Caulis Passifrorae，and them was researched by Morphologica characters identification，microscopic identification and thin layer chromatography，and moisture，total ash，acid insoluble ash，extract，heavy metals，pesticide residue of Caulis Passifrorae were determined.Results To confirm the original plants of Caulis Passifrorae are Passiflora wilsonii.The structural characteristics of setm and leaf cross sections and the powder identification characteristics of ethnicemedicine Caulis Passifrorae were clarified.The identification method of TCL was preliminary estabished.To confirm quality control regulationsof Caulis Passifrorae.Conclusion To established methods can be used to evaluate the quality of etnnicemedicine Caulis Passifrorae.

Keywords：Ethnicemedicine;Quality Standard;Passiflora wilsonii Hemsl.;Microscopic Identification;Hepatitis

锅铲藤，又名锅铲叶、半截叶、金边莲，来源为西番莲科西番莲属植物镰叶西番莲Passiflora wilsonii Hemsl.，药部位有全草、叶、根或者藤茎，分布于云南省东南至西南部地区、广西、贵州，生于海拔1000～2500m的山坡、沟谷林下、路边杂木林、土坡水沟边、灌木丛中［1］。锅铲藤作为云南各少数民族地区常用的药物，使用历史悠久，在云南各地少数民族的医药文献中均有记载。笔者通过实地走访调查和查阅文献资料［2-5］，发现在云南各州市地区的傣族、景颇族、彝族等少数民族的民间医生均有使用锅铲藤的民间验方，用于治疗黄疸型肝炎、肝腹水、肾炎、肾虚阳痿、月经不调、风湿麻木等疾病。在《云南中草药选》记载：“具有燥湿，止血，消炎，生肌。治风湿腰痛，肝炎，肝硬化，肿瘤，跌打损伤，骨折。”［6］近年有研究［7］证实，镰叶西番莲地上部分水提取物对乙醇诱导小鼠急性肝损伤具有保护作用。锅铲藤药材曾收载于1996年版的《云南省药品标准》［8］，但此版标准没有正式对外执行，仅对锅铲藤药材的性状鉴别进行了规定。目前笔者未见国内（外）有关锅铲藤药材的生药学鉴别方面的研究文献报道。

锅铲藤在云南省民间应用广泛，临床效果好，但其文献记载的基原植物形态、使用部分和药材名称并未统一，也没有现行完善的质量标准，加上野生资源近几年急剧下降，生长范围缩小，样品采集困难，使其推广应用受到限制。本实验综合文献资料和实地走访调查民间使用情况，确定锅铲藤基原植物为西番莲科西番莲属植物镰叶西番莲Passiflora wilsonii Hemsl.，药用部位为藤茎及叶，通过对基原植物的性状鉴别、显微鉴别和薄层鉴别研究，检测锅铲藤药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、重金属、农药残留，建立其质量标准，为民族药的资源开发利用提供实验依据，确保其临床用药的正确安全有效，也为其今后农业种植和经济推广该药材打下坚实基础。

1 材料与仪器

1.1 材料 13份样品均采自于云南地区（见表1），标本经中科院昆明植物所杨文光副研究员鉴定为西番莲科西番莲属植物镰叶西番莲Passiflora wilsonii Hemsl.。

1.2 仪器与试剂ICAPRQ ICPMAS仪（美国 ThermoFisher），Multiwave pro 消解仪（奥地利 安东帕），7890A气相色谱仪（美国Agilent ），Nikon 80i 生物数码摄影显微镜（日本Nikon），TP1020全自动组织脱水机（德国 Leica），LeicaRM2235轮转切片机（德国 Leica），101A-2电热干燥箱（宁波自动化仪表厂），SB-5200D超声波清洗机（功率：360W；频率：40KHz），FW177高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。高效硅胶G（青岛海洋化工有限公司）；实验所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别 本品可全年采收。本品粗茎切成不规则段节。茎呈圆柱形或椭圆柱形，稍弯曲，直径0.5～4cm，茎暗棕色，有明显较深纵纹和皮孔，表面粗糙而带钝刺状突起；体轻，质硬，不易折断，断面不平坦，淡黄色，皮部窄，木部呈放射状排列，有针尖大小的小孔（导管），髓部圆形而小。叶多破损，完整的叶形似锅铲，长3～8cm，宽5～12cm，纸质，先端截形，略成三尖头，叶的上端略平截而两侧角具锐尖，主脉5条，叶面具细网脉纹，背面叶脉及脉腋具短柔毛；叶柄长3～4cm，具腺体1枚。叶腋具细长的卷须。气微，味甘、微苦。如图1所示。

2.2 显微鉴别 采用石蜡切片法［9］，取镰叶西番莲的藤茎及叶，切成一定规格，经 FAA 固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→脱蜡→染色→封藏→标注，制备植物组织石蜡切片。置显微镜下观察。利用水合氯醛透化和稀甘油装片法制作水装片和透化片进行粉末显微观察、鉴定、描述。

2.2.1 藤茎横切面 其最外层为木栓层，为数十层细胞，含有棕色物质。皮层窄，为数列细胞，散在石细胞群。中柱鞘部位有为木化的纤维群，韧皮部筛管群明显。形成层不连续成环，为一列细胞。木质部发达，导管类圆形或类三角形，大多单个散在或数个相聚，呈放射状排列，木射线明显，为宽数十余列木薄壁细胞组成。髓部小，由细胞壁稍厚的薄壁细胞组成。薄壁细胞中含有较多的草酸钙簇晶。如图2、3所示。

2.2.2 叶（主脉）横切面 上下表皮均为1列横向延长的细胞，外被角质层。非腺毛壁增厚，基部稍弯曲，含有棕色物质。栅栏细胞2～3列，近长方形，过中脉，与海绵细胞分化不明显。海绵组织细胞小，略呈长圆形，排列疏松。主脉维管束外韧型，上下两侧均有微木化的纤维束和厚壁组织。薄壁细胞中含有草酸钙簇晶。如图4、图5所示。

2.2.3 粉末灰褐色 木栓细胞黄棕色，壁增厚。薄壁细胞为类长方形或类方形。石细胞多见，单个或数个成群，类方形、类圆形或不规则形，壁厚，孔沟明显。导管主要为具缘纹孔导管，纹孔呈类椭圆，直径27～83μm，可见螺纹导管。韧皮纤维，类长方形，非木化，纹孔较多。木纤维甚多，壁厚，直径46～80μm。非腺毛为多细胞或单细胞，顶端渐尖。草酸钙簇晶多见，棱角较钝或锐尖，直径8～25μm。棕色块散在，形状、大小及颜色深浅不一。 如图6所示。

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 取13批锅铲藤药材的藤茎粉末2.0 g（过三号筛），加乙酸乙酯50 mL，超声处理30 min，放冷，滤过。滤液水浴蒸干，残渣加 1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。

2.3.2 薄层色谱条件 点样量：供试品溶液各10 μL；薄层板：硅胶G板；展开系统：分别考察三氯甲烷-乙醚（8∶2）、三氯甲烷-石油醚（30～60 ℃）-甲酸（8∶2∶0.1）、甲苯-丙酮-甲酸（8∶2∶0.2）3种极性不同的展开剂进行上行展开；检视方式：晾干，在365 nm紫外灯下检视。

2.3.3 样品测定结果 13个产地锅铲藤藤茎的提取液薄层色谱中，以甲苯-丙酮-甲酸（8∶2∶0.2）为展开系统较良好，薄层板显明显3个蓝色的荧光主斑点。如图7所示。

2.4 检查水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物 按照2020年版《中国药典》（四部）通则0832水分测定法第二法测定水分，通则2302灰分测定法测定总灰分和酸不溶性灰分，通则2201浸出物测定法测定醇溶性浸出物（浸出物方法考察以甲醇、无水乙醇、乙醇、70%乙醇和稀乙醇溶剂的热浸法，结果以稀乙醇为溶剂提取最高，故选用稀乙醇为醇溶性浸出物溶剂），对13批锅铲藤每批样品进行平行测定2次。结果显示，6批锅铲藤药材的水分测定值为8.92%～9.72%，平均值为9.33%；总灰分测定值为6.87%～7.81%，平均值为7.33%；酸不溶性灰分测定值为0.11%～0.30%，平均值为0.16%；醇溶性浸出物测定值为16.67%～18.92%，平均值為17.58%。结果见表2。

2.5 重金属测定

2.5.1 试药试剂 65 %硝酸［优级纯，默克化工技术（上海）有限公司］，超纯水（德宏州食品药品检验所实验室提供）。 铅（Pb）（批号：GSB-1742-2004； 浓度：1000 μg/mL）、镉（Cd）（批号：GSB-1721-2004；浓度：1000 μg/mL）、砷（As）（批号：GSB-1714-2004 ；浓度：1000 μg/mL）、铜（Cu）（批号：GSB-1725-2004 ；浓度：1000 μg/mL）、汞（Hg）（批号：GSB-1729-2004 ；浓度：1000 μg/mL）、金（Au）（批号：GSB-1715-2004 ；浓度：1000 μg/mL）、锗（Ge）（批号：GSB-1728-2004 ；浓度：1000 μg/mL）、铟（In）（批号：GSB-1731-2004 ；浓度：1000 μg/mL）、铋（Bi（批号：GSB-1719-2004 ；浓度：1000 μg/mL）标准液均购于国家有色金属及电子材料分析测试中心。

2.5.2 方法 按照《中国药典》2020版四部通则2321铅、镉、砷、汞、铜测定法电感耦合等离子体质谱法测定重金属。

2.5.2.1 ICP-MS测定条件 功率：1200.00 W；冷却气体体积流量（氩气）：15.00 L/min;辅助气体积流量（氩气）：1.00 L/min；雾化气体积流量（氩气）：1.00 L/min；采样锥和截取锥：镍；采样深度：8.0 mm；测量方式：调峰模式；扫描次数：25；重复次数：3；采用STD模式；蠕动泵转速：35 r/min。

2.5.2.2 混合内标溶液制备 分别吸取Ge、In、Bi标准溶液0.1 mL于100 mL量瓶中，加入Au元素标准溶液0.1 mL，再加10%硝酸溶液定容至刻度，即为浓度1 μg/mL混合内标溶液。按照《中国药典》2020版四部通则2321方法，以Ge为内标物测定PAs、Cu元素，以In为内标物Cd元素，以Bi为内标物测定Pb、Hg元素。

2.5.2.3 线性关系考察 分别吸取Pb、Cd、As、Cu、Hg标准溶液0.1 mL置于100 mL量瓶中，加超纯水定容，配置呈浓度1 μg/mL 的混合标准溶液贮备液。分别吸取贮备液为0 μL、5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1000 μL置于100 mL量瓶中，各加入1 mL混合内标溶液，再加10%硝酸溶液定容，即得到0 μg/L、0.05 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2.5 μg/L、5 μg/L、10 μg/L混合标准品溶液。分别进样测定Pb、Cd、As、Cu、Hg元素。以待测元素与对应的内标元素信号值之比对元素质量浓度进行线性回归，得到回归方程（见表3）。结果表明，5种重金属元素在0～10 μg/L线性关系良好。

2.5.2.4 供试品溶液制备 精密称取0.25 g样品（过三号筛）于聚四氟乙烯高压微波消解罐中，依次加入65%硝酸8 mL，放置加热（80 ℃）预消解2 h，在放置于微波消解仪中，用2步梯度升温法消解（30 min内温度由室温升至160 ℃，保持15 min；在于5 min内升至200 ℃，保持15 min）。然后，逐渐冷却至55 ℃。消解液冷却至室温，经0.22 μm滤膜过滤，转至25 mL量瓶中，加入1 mL混合内标溶液，再加超纯水定容至刻度，摇匀，即可。

2.5.2.5 空白对照溶液的制备 除不加锅铲藤样品外，其余制备方法与供试品溶液制备方法相同，制成空白对照溶液。

2.5.2.6 方法学考察 精密度试验：取混合标准品溶液连续进样6次，测定5种元素的量，进行计算，Pb、Cd、As、Cu、Hg的RSD分别为2.12%、1.85%、1.03%、1.27%、4.32%。表明仪器的精密度良好。

重复性试验：取同一批号锅铲藤样品6份，制备成供试品溶液，测定5种重金属元素。得到Pb、Cd、As、Cu、Hg的RSD%分别为3.12%、1.65%、2.53%、2.83%、4.92%。表明方法的重复性良好。

稳定性试验：取同一批号锅铲藤样品，在测定条件下，分别于在样品制备后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h进样，测定5种重金属元素的量。结果显示，Pb、Cd、As、Cu、Hg的RSD分别为1.87%、2.33%、2.79%、3.02%、7.84%。除了Hg元素，其他4种重金属元素在制备36 h内各元素是稳定的。

检验限测定：吸取10 mL稀释溶液（10%硝酸溶液），在相同的方法条件下测定，重复6次测定稀释溶液。以某元素测定结果标准偏差的3倍值（3δ）除以该元素回归方程的斜率（k），即为该元素的检测限。Pb、Cd、As、Cu、Hg的检测限分别为0.159 μg/L、0.753 μg/L、0.792 μg/L、0.013 μg/L、0.133 μg/L、0.127 μg/L。

样品测定：按照供试品制备方法，测定供试品溶液中5中重金属元素的量，再扣除空白对照溶液的各元素的量，得到锅铲藤样品中5种重金属的量。每一批号锅铲藤进行了2次平行试验，取平均值计算，即得到13份锅铲藤样品5种重金属的量。测定结果见表4。结果表明，批号为20190421的样品测定的Pb、Cu两个元素量高于标准［9］规定，其他批号的锅铲藤样品均在限制之内。

根据2001年我国对外贸易经济合作部颁布的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》对药用植物原料、饮片等的限量标准［10］，为铅（Pb）≤5.0 mg/kg；镉（Cd）≤0.3 mg/kg；砷（As）≤2.0 mg/kg；汞（Hg）≤0.2 mg/kg；铜（Cu）≤20.0 mg/kg。结果，批号为20190421的样品中铅、铜元素超标，其余批号的重金属元素的量均符合标准，说明不同产地的锅铲藤中5种重金属元素有明显差异。

2.6 农药残留测定 取锅铲藤药材样品，按照《中国药典》［11］2020版四部通则2341农药残留量测定法第一法测定农药残留，检测结果：六六六 /（μg/kg）；滴滴涕 /（μg/kg）；五氯硝基苯 /（μg/kg），测定农药残留量均低于检出限，为0.0000 mg/kg，农药残留符合其要求。

3 讨论

本研究对锅铲藤进行较全面的生药学研究，筛选出各类具有鉴别意义的特征，如锅铲藤性状鉴别特征为茎呈圆柱形或椭圆柱形，表面粗糙而带钝刺状突起；体轻，质硬，不易折断，皮部窄，木部呈放射状排列，有针尖大小的小孔（导管），髓部圆形而小。叶多破损，完整的叶形似锅铲，纸质，先端截形，叶腋具细长的卷须。显微特征为藤茎横切面最外层为木栓层。皮层窄，散在石细胞群。中柱鞘部位有为木化的纤维群，韧皮部筛管群明显。木质部发达，导管类圆形或类三角形，呈放射状排列，木射线明显。髓部小。薄壁细胞中含有较多的草酸钙簇晶。叶横切面上下表皮均为1列横向延长的细胞，外被角质层。主脉维管束外韧型，上下两侧均有微木化的纤维束和厚壁组织。薄壁细胞中含有草酸钙簇晶。粉末多见石细胞、木栓细胞、韧皮纤维、木纤维、薄壁细胞、棕色块、非腺毛、草酸钙簇晶，导管主要为具缘纹孔导管。

在薄层色谱鉴别项，结果表明，13个产地锅铲藤藤茎的提取液，以甲苯-丙酮-甲酸（8∶2∶0.2）为展开系统较良好，薄层板显明显3个蓝色的主斑点，分离良好，斑点清晰，且具有较好的重现性。在重金属测定检查项目，仅有批号为20190421的锅铲藤样品测定的Pb、Cu两个元素超标，可能与药材的生长环境、采样加工等因素有一定相关性，具体原因仍需要有关学者进一步研究其确切原因。在农药残留测定检查项目，13批样品均未检出（低于检出限），说明锅铲藤药材的安全性控制指标符合要求，可以较好保障临床安全使用。

锅铲藤药材为民间常用药，但该药材质量标准尚属空白，制约其推广和临床应用。余继华等［12］从云南产地的镰叶西番莲藤茎中可分离得到6个化合物。李干鹏［13］在其博士学位论文《五种云南药用植物化学成分研究》中发表镰叶西番莲藤茎中可分离得到14个化合物，主要是三萜和甾体类的化合物。本课题通过对锅铲藤药材基原植物鉴定、性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别的研究，测定其水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇浸出物、重金属、农药残留，能较好的鉴别该药材，可为锅铲藤鉴别和药材质量标准的制订提供参考依据，同时也为锅铲藤的综合开发利用的相关研究奠定了生药学基础，这些研究结果对于日后扩大锅铲藤药用资源、临床用药和新药开发方面具有重要意义。本研究中所用的样品大多数为野生品种，生长环境为高山丛林，存在采样难度大的问题，故样品批数数量较少，后续本课题组将继续采集其他不同产地、不同年限的样品进行研究，以建立更加完善的药材质量标准。

参考文献

［1］宁小清，谈远锋，刘寿养.广西植物分布新记录［J］.广西植物，2013，33（2）：283-284.

［2］马小军，张丽霞，林艳芳.中国傣药志［M］.北京：人民卫生出版社，2018： 516.

［3］陈眉，唐贞力，杨维光，等.民族药锅铲叶临床应用的整理研究［J］.中国民族民间医药杂志，2013，18（18）：5.

［4］袁凯文，字燕.半截叶治疗急性黄疸型肝炎［J］.中国民族民间医药杂志，2006，15（8）：24.

［5］彭朝忠，祁建军，李先恩.沧源县佤族酒疗法验方录［J］.中国民族民间医药杂志，2011，20（4）：8.

［6］昆明军区后勤部卫生部.云南中草药［M］.昆明：云南人民出版社，1971：213.

［7］卢传礼.镰叶西番莲地上部分水提取物对乙醇诱导小鼠急性肝损伤的保护作用研究［J］.植物资源与环境学报，2020（1）：72-74.

［8］云南省卫生厅.云南省药品标准［M］.昆明：云南大学出版社，1996：116.

［9］赵中振，陈虎彪.中药显微鉴定图鉴［M］.福建：福建技术出版社，2016：16.

［10］佚名.中华人民共和国外经贸行业标准药用植物及制剂进出口绿色行业标準［J］.中国经贸，2001（7）：44-45.

［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.四部.北京：中国医药科技出版社，2020：239-241.

［12］余继华，李干鹏，赵静峰，等.镰叶西番莲的化学成分［J］.天然产物研究与开发，2003，15（1）：27-28.

［13］李干鹏.五种云南药用植物化学成分研究［D］.兰州：兰州大学，2004.

（收稿日期：2022-09-06 编辑：陶希睿）