多组学分析LARP1在泛癌中的表达及其与患者预后、肿瘤微环境的关系

刘 鑫，胡福境，苏 颖，曾毅飞，潘芳莲，覃桂聪

(广西医科大学附属武鸣医院消化内科，广西 南宁 530199)

RNA 结合蛋白(RBP) 具有高度动态的时空调控作用和重要的生物学功能，它们通过转录后控制RNA 的加工和运输，包括调节RNA 剪接、聚腺苷酸化、mRNA 稳定性、mRNA 定位和翻译，对维持转录组稳定至关重要[1]。人类RBPs 约有2000 种，占蛋白质编码基因的7.5%。越来越多的研究表明，RBPs 介导的RNA 修饰在癌症进展中具有重要作用，它们可在不同类型的癌症中异常表达，同时可调节癌基因和抑癌基因的表达和功能[2]。La 相关蛋白1 (LARP1) 是一种进化保守的RNA 结合蛋白，属于LARP 超家族的一员。它在果蝇体内首次被发现，被证明可与聚腺苷酸结合蛋白(PABP) 结合，是胚胎发育和生育所必需的RNA 结合蛋白。研究表明，LARP1 是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 通路与TOP mRNA 调控之间的重要的链接蛋白，是mTORC1 的底物，通过它的多个结构域如LaM、RRM-L、PABP 结合域、DM15 域的mRNA 结合，既可以调节以5′末端寡核苷酸( 5′TOP)基序为特征的mRNA 的稳定性和转译，也可与某些5′TOP mRNA 的3′ 端多聚A 尾结合调节mRNA 的功能[3]。在宫颈癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多种癌症中，LARP1 的高表达与临床转归之间的关系密切[4-6]。虽然研究表明LARP1 在多种肿瘤中均有促癌的作用，但目前仍缺乏它在泛癌中作用及相关机制的分析。因此，本研究运用多种数据库对LARP1 的功能进行了系统分析，利用多组学数据证明LARP1 是影响患者肿瘤发生和临床预后的关键分子，也是泛癌微环境中的关键调控因子。

1 资料与方法

1.1 基于TIMER 数据库分析LARP1 在肿瘤组织中的表达谱

TIMER 2.0（http://timer.cistrome.org/）是一个分析各种癌症中免疫细胞浸润的在线资源数据库。该数据库采用反卷积方法作为统计方法，可从基因表达谱中推断肿瘤组织中免疫细胞的浸润丰度。本研究主要是应用Cancer Exploration 模块中的 Gene_DE 模块分析LARP1 在33 种TCGA 数据库肿瘤组织中的表达。

1.2 不同肿瘤组织中LARP1 蛋白的表达水平以及启动子甲基化水平

应用UALCAN 数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）分析LARP1 在乳腺癌 （BRCA）、卵巢癌 （OV）、结肠癌（COAD）、肾透明细胞癌（KIRC）、子宫内膜癌（UCEC）和肺腺癌 （LUAD）组织中的表达情况及甲基化情况。

1.3 LARP1 基因在 肿瘤中的改变情况

应用cBioPortal 数据库（https://www.cbioportal.org/）分析LARP1 在肿瘤中的改变情况。

1.4 分析LARP1 与肿瘤临床病理分期的关系

应用R 语言(3.6.3 版本)ggplot2(3.3.3 版本)R 包对TCGA 数据库中的肿瘤数据进行分析，应用多重假设检验(Dunn’s test) 法分析LARP1 在不同肿瘤分期中的意义。

1.5 预后分析

根据Kaplan-Meier 曲线分析29 种癌症中LARP1表达与患者预后〔包括总生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)〕之间的关系。应用单因素生存分析法计算危险比(HRs) 和95% 置信区间。

1.6 肿瘤中LARP1 与免疫细胞浸润的相关性

采用TCGA 数据库的数据，应用R 语言(3.6.3 版本)GSVA 包(1.34.0 版本)(Hänzelmann et al, 2013) 中的ssGSEA 分析各种肿瘤中LARP1 与24 种免疫细胞浸润的相关性，结果以热图显示。

1.7 肿瘤中LARP1 与免疫检查点的相关性分析

采用SangerBox 数据库，对LARP1 蛋白表达水平与免疫检查点基因表达水平的相关性进行分析。在UCSC(https://xenabrowser.net/) 数据库中下载经统一标准化的泛癌数据集：TCGA TARGET GTEx(PANCAN,N=19131,G=60499), 进一步从中提取LARP1 基因和60 个两类免疫检查点途径基因Inhibitory(24)、Stimulatory(36)，对每一个表达值进行log2(x+0.001) 变换，计算LARP1 与免疫途径标记基因的pearson 相关性。

2 统计分析

采用R 软件包（3.6.3 版本）进行统计学分析。采用Mann-Whitney U 检验法分析LARP1 mRNA 在泛癌中的表达情况，将Survival 包（3.2-10 版本）用于生存治疗分析，采用Bonferroni 法校正的显著性水平多重假设检验(Dunn’s test) 法分析LARP1 与病理分期的相关性，将GSVA 包(1.34.0 版本) 用于免疫浸润关联性分析。

3 结果

3.1 泛癌中LARP1 mRNA 的表达水平

TIMER 数据库分析结果显示，相较于正常组织，LARP1 在 BLCA、BRCA、CHOL、COAD、HNSC、KICH、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、STAD中的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；在GBM、KIRP、THCA 中的表达明显减低（P＜0.05）。见图1。

3.2 不同肿瘤组织中LARP1 蛋白的表达水平以及DNA 甲基化水平

利用UALCAN 数据库 CPTAC 模块分析 9 种癌组织中LARP1 蛋白的表达水平。与癌旁正常组织比较，LIHC、OV、COAD、BRCA、KIRC、LUAD 、UCEC组织中 LARP1 蛋白的表达水平明显升高 （P＜0.01），GBM 和PAAD 组织中LARP1 蛋白的表达水平明显降低（P＜0.01）( 见图2)。DNA 甲基化分析也发现，在 BRCA、CHOL、COAD、LUAD、UCEC 等肿瘤组织中LARP1 DNA 甲基化水平显著降低（见图3）。

图2 CPTAC 数据库分析LARP1 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达水平

图3 TCGA 数据库分析LARP1 蛋白在肿瘤中LARP1 启动子甲基化的水平

3.3 LARP1 基因在肿瘤中的改变情况

使用cBioPortal (TCGA, pan-cancer Atlas)数据库研究LARP1 基因在泛癌中改变情况的结果显示，子宫内膜癌LARP1 基因突变率最高，达7.51% ；几乎所有的肿瘤中都存在LARP1 基因突变的情况（见图4a），LARP1 基因突变明显影响肿瘤患者的总体生存率（见图4b）。

图4a LARP1 基因在泛癌中的改变情况

图4b LARP1 基因改变对肿瘤患者总体生存率的影响

3.4 LARP1 与肿瘤病理分期的关系

应用R 语言(3.6.3 版本)ggplot2(3.3.3 版本)R 包对TCGA 数据库中的不同病理分期（Stage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的肿瘤数据进行分析，观察LARP1 与肿瘤分期的关系，结果发现LARP1 表达升高与LIHC、LUAD、SKCM、LUSC、ACC、STAD、THCA 病理分期明显相关（见图5）。

图5 LARP1 与肿瘤病理分期的关系

3.5 LARP1 表达与癌症患者预后之间的关系

生存分析结果显示，LARP1 与ACC、BRCA、CESC、HNSC、KIRC、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UCEC、UVM 患者的总生存期明显相关；其中LARP1 的高表达与ACC、BRCA、CESC、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UCEC、UVM、HNSC 预后差明显相关（见图6a）。疾病特异性生存期（DSS）方面的结果显示LARP1的表达情况影响了ACC、BRCA、CESC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UVM 13 种肿瘤的DSS（见图6b）。

图6a LARP1 表达与肿瘤OS 的关系

图6b LARP1 表达与肿瘤DSS 的关系

3.6 LARP1 与免疫细胞浸润的关系

R 语言分析结果显示，LARP1 的表达水平与ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD 等19 种肿瘤组织中免疫细胞（活化的树突状细胞、B 细胞、CD8+T淋巴细胞、细胞毒性细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、免疫性树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、NK 细胞亚群CD56bright、NK 细胞亚群CD56dim、NK 细胞、浆细胞样DC 细胞、T 淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞、中央记忆性T 淋巴细胞、滤泡辅助性T 淋巴细胞、γδT 细胞、Th1 细胞、Th17 细胞、Th2 细胞和调节性T 淋巴细胞）的表达水平有明显的相关性（0 ＜r＜1，P＜0.01）。其中与辅助性T 淋巴细胞、中央记忆性T 淋巴细胞、Th2 细胞在大多数肿瘤中呈正相关（见图7）。

图7 各种肿瘤中LARP1 表达与免疫细胞浸润的相关性

3.7 LARP1 蛋白表达水平与免疫检查点基因表达的相关性

采用SangerBox 数据库，对LARP1 蛋白表达水平与免疫检查点基因表达水平的相关性进行分析，结果如图8 所示。LARP1 在众多肿瘤中与刺激性和抑制性免疫检查点的表达均有显著的相关性。

图8 LARP1 蛋白表达水平与免疫检查点基因表达水平的相关性

4 讨论

目前，肿瘤仍然是威胁人类健康的主要疾病之一，世界范围内发病率排名前三的肿瘤是乳腺癌、肺癌、结肠癌[7]。针对恶性肿瘤的治疗方式主要有手术、化疗、放疗以及基于检查点的免疫疗法、分子靶向治疗，早期发现和有效治疗是改善癌症患者预后的重要前提。肿瘤患者个体化的精准治疗是提高患者预后的关键，其中分子靶向药物治疗疗效显著，副作用小，但药效的个体差异较大。免疫检查点蛋白(ICP) 的鉴定是免疫学中最热门的研究课题之一。ICP 能够以环境依赖性的方式调节多种免疫功能。针对癌症患者的ICP 治疗，常用的药物是ICP 的抑制剂，它可以阻断免疫检查点对肿瘤细胞的保护作用，克服传统癌症治疗的局限性，相关实验中已经取得了较好的效果，有数种药物已经应用于临床[8]。因此，单基因的泛癌生物信息学分析有助于研究不同癌症之间的异同，研究其与免疫细胞及免疫检查点的关系，可为癌症预防和个性化靶向治疗及免疫治疗策略的设计提供依据。

通过分析，我们发现RNA 结合蛋白LARP1 在BLCA、BRCA、CHOL、COAD、HNSC 等多种肿瘤与正常组织中存在明显的表达差异，且与肿瘤的分期和预后存在明显的相关性。目前国内的多个研究已证实LARP1 的表达与卵巢癌、肺癌、胃癌、结肠癌及胆囊癌的预后明显相关，随着研究的深入，LARP1 有望成为评估特定肿瘤患者预后的一个潜在的重要标志物。

DNA 甲基化是一种在表观遗传基因表达调控、基因组印记、X 染色体失活、转座子沉默和基因组稳定性方面发挥重要作用的化学修饰过程，异常DNA甲基化模式是肿瘤细胞的特点之一；基因启动子的DNA 高甲基化使基因转录受抑，常导致癌细胞中抑癌基因的沉默或失活[9]。分析发现在BRCA、CHOL、COAD、LUAD、UCEC 等肿瘤组织中，LARP1 DNA甲基化水平显著降低，同时这些肿瘤中的LARP1 呈高表达，故DNA 甲基化与LARP1 表达的关系值得进一步研究。除此之外，在众多肿瘤中都存在LARP1基因突变、扩增和深度缺失等情况，LARP1 基因的这些改变似乎能改善肿瘤的总体死亡率，LARP1 基因改变对不同类型肿瘤的影响有待深入研究。

肿瘤微环境（TME）包括肿瘤中的所有非癌性宿主细胞，包括成纤维细胞、内皮细胞、神经元、脂肪细胞、适应性和先天免疫细胞（如T 淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞等），以及其非细胞成分，包括细胞外基质(ECM) 和可溶性产物，如趋化因子、细胞因子、生长因子和细胞外囊泡。TME 在癌症特征的获得和维持中发挥着重要作用，如维持增殖信号、抵抗细胞死亡、诱导血管生成、激活侵袭和转移、引发肿瘤促炎、避免免疫破坏[10]。针对TME 中成分的治疗，是肿瘤治疗的一个新方向，例如靶向成纤维细胞表面FAPα特异性抗原的西罗株单抗和在研多种针对肿瘤相关巨噬细胞的药物均已取得可喜的临床和实验结果[11]。我们通过分析发现，LARP1 在肿瘤中与树突状细胞、辅助性T 淋巴细胞、NK 细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞存在相关性，其中与辅助性T 淋巴细胞、中央记忆性T 淋巴细胞、Th2 细胞在大多数肿瘤中呈正相关。我们分析各种肿瘤中LARP1 与免疫检查点的关系发现，在大多数肿瘤中，LARP1 与刺激性和抑制性免疫均呈正相关，这显示了肿瘤免疫环境的复杂性，说明LARP1 参与了肿瘤生存、发展的免疫调控作用，对其具体机制的研究具有重要意义。

5 结论

通过泛癌分析发现，LARP1 在多种肿瘤中异常表达，与多种肿瘤患者的预后密切相关；与多种癌症中活化的树突状细胞、B 细胞、CD8+T 淋巴细胞、细胞毒性细胞、嗜酸性粒细胞、免疫性树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞等免疫细胞的浸润相关。在多种癌症中，均可观察到LARP1 甲基化减少,LARP1 的表达与免疫检查点标记物的表达显著相关。进一步研究LARP1 在癌症中的分子机制对癌症的诊治具有非常重要的意义。